Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор. Структуры тритерпеновых гликозидов голотурий отрядов Dendrochirotida и Elasipodida. Биологическая активность и экологическая роль, возможные пути биосинтеза гликозидов 16
2.1. Введение 16
2.2. Структуры гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida 17
2.2.1. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae 17
2.2.2. Гликозиды голотурий семейства Phyllophoridae 33
2.2.3. Гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae 36
2.2.4. Гликозиды голотурий семейства Psolidae 38
2.3. Структуры гликозидов голотурий отряда Elasipodida (семейства Elpidiidae) 40
2.4. Метаболомные масс-спектрометрические исследования гликозидов голотурий 41
2.5. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий. Закономерности взаимосвязи «структура – активность» 44
2.6. Биосинтез агликонов тритерпеновых гликозидов голотурий: что нам известно? 46
3. Обсуждение результатов 51
3.1. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Synaptidae отряда Apodida 51
3.1.1. Установление структур синаптозидов А и А1 из голотурии Synapta maculatа 51
3.1.2. Структуры гликозидов и систематическое положение Synapta maculata 55
3.2. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Cucumariidae, отряд Dendrochirotida 59
3.2.1. Установление структур гликозидов голотурии Cucumaria okhotensis 59
3.2.2. Тритерпеновые гликозиды Cucumaria okhotensis и систематика голотурий рода Cucumaria 72
3.2.3. Новый гликозид из голотурии Cucumaria japonica 73
3.2.4. Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Actinocucumis typica 78
3.2.5. Гликозиды из Actinocucumis typica как иллюстрация параллельной химической эволюции гликозидов в различных таксонах голотурий 89
3.2.6. Туркветозид А – гликозид с остатком 3-О-метилхиновозы из антарктической голотурии Staurocucumis turqueti 90
3.2.7. Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Pseudocolochirus violaceus 94
3.2.8. Структуры тритерпеновых гликозидов голотурии Pseudocolochirus violaceus и ее таксономический статус 103
3.2.9. Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Colochirus robustus 105
3.2.10. Некоторые химические свойства агликона колохирозида Е, имеющего 18(16)-лактон 128
3.2.11. Установление структур гликозидов из голотурии Cucumaria fallax 131
3.2.11.1. Биогенетическая взаимосвязь структур гликозидов голотурии C. fallax 145
3.2.11.2 Установление структур фаллаксозидов D3 и В1 – гликозидов с новыми типами полициклических систем из голотурии Cucumaria fallax 151
3.2.12. Возможные пути биосинтеза агликонов фаллаксозидов D3 и В1 160
3.2.13. Анализ структур гликозидов голотурии Cucumaria fallax и ее систематическая принадлежность 162
3.3. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae, отряд Dendrochirotida 163
3.3.1. Установление структур гликозидов голотурии Eupentacta fraudatrix 163
3.3.2. Анализ структурного разнообразия, количественного содержания гликозидов и выполняемых ими функций в голотурии Eupentacta fraudatrix 206
3.3.3. Особенности биогенеза углеводных цепей гликозидов E. fraudatrix, как иллюстрация мозаичности их биосинтеза 208
3.3.4. Установление структур гликозидов голотурии Cladolabes schmeltzii 211
3.3.5. Анализ путей биогенеза агликонов и углеводных цепей гликозидов C. schmeltzii 283
3.4. Гликозиды голотурий семейства Phyllophoridae, отряд Dendrochirotida 287
3.4.1. Установление структур гликозидов голотурии Massinium (=Neothyonidium) magnum 287
3.4.2. Биогенез агликонов голостанового и неголостанового типов в гликозидах M. magnum. Гликозидный состав Massinium (=Neothyonidium) magnum как пример внутривидового варьирования разнообразия гликозидов 303
3.5. Тритерпеновые гликозиды голотурий семейства Elpidiidae отряда Elasipodida 306
3.5.1. Установление структур гликозидов голотурии Kolga hyalinа 306
3.5.2. Причины сходства в структурах гликозидов арктических и антарктических видов голотурий семейства Elpidiidae 311
3.6. Биосинтетические трансформации агликонов тритерпеновых гликозидов голотурий 312
3.6.1. Общие закономерности биосинтеза углеводных цепей гликозидов в голотуриях 320
3.7. Анализ взаимосвязи «структура–активность» новых тритерпеновых гликозидов 321
3.7.1. Зависимость цитотоксической активности от строения углеводной цепи 323
3.7.2. Влияние числа и положения сульфатных групп на цитотоксическую активность, проявляемую гликозидами 325
3.7.3. Зависимость цитотоксической активности гликозидов от структуры агликона 326
3.7.4. Влияние гидроксильной группы в боковой цепи агликона на цитотоксическую активность, проявляемую гликозидами 327
4. Экспериментальная часть 330
5. Заключение 374
6. Выводы 378
7. Список цитированной литературы 380
- Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae
- Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Colochirus robustus
- Установление структур гликозидов голотурии Cladolabes schmeltzii
- Биосинтетические трансформации агликонов тритерпеновых гликозидов голотурий
Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae
Cемейство Cucumariidae – наиболее многочисленное в отряде по числу родов (их 68), входящих в его состав. Причем род Cucumaria, включающий такие массовые промысловые виды как C. japonica, C. frondosa и C. okhotensis является наиболее изученным с химической точки зрения.
Как и в случае с гликозидами голотурий отряда Аspidochirotida, изучение гликозидов представителей отряда Dendrochirotida началось с получения нативных генинов и установления их структур. Были изучены агликоны, полученные из гликозидных фракций голотурий Cucumaria japonica [15], C. echinata (=Pseudocnus echinatus) [16], C. frondosa [17], Eupentacta (=Cucumaria) fraudatrix [18], Parathyona sp. [19], Duasmodactyla (=Thyonidium) kurilensis [20].
Cucumaria japonica
Тихоокеанская дальневосточная голотурия Cucumaria japonica попала в число первых видов отряда Dendrochirotida, из которых были выделены тритерпеновые гликозиды и установлены их полные структуры. Самым первым таким соединением был моносульфатированный пентаозид, кукумариозид А2-2 (8) [21]. Всего из C. japonica было выделено тринадцать гликозидов - кукумариозидов семи различных групп (А0–А7). В пределах одной группы вещества отличались друг от друга строением агликонов, а различия между группами кукумариозидов заключались в строении их пентасахаридных углеводных цепей, отличающихся моносахаридным составом, а также количеством и положением сульфатных групп. Общие черты строения, характерные для кукумариозидов всех семи групп: первым и пятым моносахаридными остатками является ксилоза, причем первая ксилоза сульфатирована по положению С-4; остаток хиновозы занимает второе положение в углеводных цепях. Различия между группами касались третьего и четвертого моносахаридных звеньев.
Кукумариозиды групп А0, А1, А2 и А4 представляют собой моносульфатированные гликозиды. Третьим моносахаридным остатком в углеводной цепи кукумариозидов группы А0 является ксилоза, а в роли терминального остатка выступает типичная для этого положения 3-О-метилглюкоза. Все соединения этой группы (кукумариозиды А0-1 (4), А0-2 (5), А0-3 (6)) имеют голостановые агликоны с 7(8)-двойной связью и отличаются друг от друга строением боковых цепей и функциональной группой в положении 16 [22, 23].
Из суммы гликозидов группы А1 удалось выделить только один гликозид – кукумариозид А1-2 (7), который имеет ацетатную группу при С-6 терминального остатка глюкозы, а третьим моносахаридным остатком в углеводной цепи является глюкоза [24]. Это первый и единственный до сих пор случай выделения из голотурий ацетилированного по углеводной цепи гликозида.
Углеводная цепь кукумариозидов группы А2 также характеризуется наличием глюкозы в качестве третьего моносахаридного остатка, терминальным остатком является 3-О-метилглюкоза. Помимо основного компонента, кукумариозида А2-2 (8) [21], из этой группы были выделены еще 2 соединения, кукумариозиды А2-3 (9) и А2-4 (10) [25]. Кукумариозид А4-2 (11) является одним из основных компонентов фракции C. japonica и единственным выделенным в индивидуальном виде представителем группы А4 [25], он содержит остатки глюкозы и в третьем, и в четвертом положениях углеводной цепи.
Группы кукумариозидов А3 и А6 включают дисульфатированные гликозиды. Кукумариозиды А3 (12) и А6-2 (13) имеют одинаковые агликоны и отличаются друг от друга положением одной из сульфатных групп [26].
Кукумариозиды группы А7 представляют собой трисульфатированные пентаозиды. Такие полярные соединения были тогда впервые найдены в голотуриях. Как показали дальнейшие исследования, они являются типичными для голотурий рода Cucumaria. Из этой фракции были выделены 3 новых соединения: кукумариозиды А7-1 (14), А7-2 (15) и А7-3 (16) [27].
Голотурия C. frondosa, собранная у Кольского побережья Баренцева моря, в качестве основного компонента гликозидной фракции также содержала фрондозид А (17). Наряду с основным гликозидом было выделено минорное соединение – фрондозид А1 (20), представляющий собой моносульфатированный тетраозид [31]. В подфракции наиболее полярных трисульфатированных гликозидов основным компонентом являлся фрондозид В статье автора из Турции, Н. Яйли, вышедшей в 2001 году в Индийском химическом журнале, описывались структуры двух моносульфатированных пентаозидов, фрондозидов Е1 (22) и Е2 (23) и трисульфатированного пентаозида, фрондозида F (24), выделенных из C. frondosa [33]. Соединения 22 и 23 отличались друг от друга положением двойных связей в ядре и боковой цепи. Структуры гликозидов устанавливались на основе анализа 13C ЯМР спектров смеси двух веществ. Утверждалось, что гликозид 22 характеризуется наличием 7(8)- и 25(26)-двойных связей, а гликозид 23 имеет 9(11)- и 24(25)-двойные связи. Однако, учитывая то, что соотношение между компонентами смеси было приблизительно 1:1.2, точное установление структур только по 13C ЯМР спектру было невозможным, так как вероятность обратной комбинации двойных связей в ядре и боковой цепи точно такая же.
Структура трисульфатированного пентаозида, фрондозида F (24) также представляется сомнительной, т.к. гликозид имеет семичленный лактонный цикл и насыщенное полициклическое ядро. Tщательный анализ спектральных данных, приведенных в этой статье, дает основания усомниться в правильности структур, т.к., по-видимому, автор работал с очень сложной смесью гликозидов, имеющих как 7(8)-, так и 9(11)-двойные связи в агликонах, что могло привести к малой интенсивности их сигналов в 13C ЯМР спектрах и ошибочной интерпретации 2D ЯМР спектров.
В 2004 году в нашем распоряжении оказался еще один образец голотурии C. frondosa, собранный в бухте Пенобскот залива Мэн (штат Мэн, США). В результате изучения ее гликозидного состава, было выделено 15 индивидуальных гликозидов, 13 из которых оказались новыми. Гликозидная фракция голотурии C. frondosa этого сбора представляла собой сложную смесь, состоящую из различных моно-, ди- и трисульфатированных гликозидов, что, как стало известно к началу наших исследований, характерно для всех изученных представителей рода Cucumaria [34]. Из подфракции моносульфатированных гликозидов, фрондозидов группы А2, было выделено 7 индивидуальных соединений: фрондозиды А2-1 (25), А2-2 (26), А2-3 (27), А2-4 (28), А2-6 (29), А2-7 (30), А2-8 (31) [35, 36]. Углеводные цепи этих соединений идентичны цепи кукумариозида А2-2 (8) из голотурии C. japonica [21]. Агликоны гликозидов 25–29 относятся к голостановому ряду и различаются наличием-отсутствием функциональных групп в положении 16 и строением боковых цепей. Агликоны соединений 30, 31 принадлежат к неголостановому типу, т.к. не содержат лактона.
Гликозиды, обнаруженные в голотурии C. frondosa, характеризуются некоторыми интересными структурными особенностями: фрондозид А2-2 (26) содержит в боковой цепи 24-кетогруппу, сопряженную с 25(26)-двойной связью, этот фрагмент тогда впервые был обнаружен в гликозидах голотурий; соединения 25 и 29 (с голостановыми агликонами) являются изомерами по положениям двойных связей в ядре и боковой цепи (7(8)- и 24(25)- и, соответственно, 9(11)- и 25(26)-), а гликозиды 30, 31 (с неголостановыми агликонами) представляют собой пару изомеров по положению двойной связи в полициклической системе. Обычно в гликозидных фракциях таких голотурий содержатся соединения, имеющие в агликонах либо 7(8)-, либо 9(11)-двойную связь.
Из подфракции трисульфатированных гликозидов, было выделено 8 индивидуальных соединений, среди которых было 5 новых гликозидов: фрондозиды А7-1 (32), А7-2 (33), А7-3 (34), А7-4 (35), изофрондозид С (36) [37]. Кроме того, три гликозида были идентифицированы с известными соединениями: фрондозидом С (21), ранее выделенным из этой же голотурии [32], кореозидом А (37), ранее найденным в голотурии Cucumaria koreaensis [38], и изокореозидом А (38), ранее выделенным из голотурии Cucumaria conicospermium [39]. Интересно, что 6 из 8 фрондозидов группы А7 содержат агликоны без лактона и только два соединения, фрондозиды А7-1 (32) и А7-2 (33) - типичные для большинства голотурий агликоны с 18(20)-лактоном. Среди фрондозидов группы А7 были найдены уже три пары изомеров, различающихся только по положению двойной связи в ядре агликонов (7(8)- или 9(11)-).
Таким образом, исследования гликозидного состава массовых промысловых видов голотурий Cucumaria japonica и C. frondosa показали, что каждый из них имеет специфический набор тритерпеновых гликозидов. Наличие в гликозидах пентасахаридных разветвленных углеводных цепей, содержащих от одной до трех сульфатных групп, является хемотаксономическим признаком голотурий рода Cucumaria [34].
Cucumaria koreaensis
Из голотурии С. koreaensis был выделен только основной компонент гликозидной фракции – кореозид А (37) [38] с трисульфатированной пентасахаридной углеводной цепью, идентичной цепи кукумариозидов группы А7 из C. japonica [27] и фрондозидов группы А7 из C. frondosa [37]. Более того, кореозид А (37) был обнаружен в гликозидной фракции C. frondosa.
Сucumaria conicospermium
Из голотурии C. conicospermium, собранной в северной части Японского моря, были выделены 4 новых гликозида – кукумариозиды A2-5 (39), A3-2 (40), A3-3 (41) и изокореозид A (38) [39], а также идентифицирован ранее найденный в C. koreaensis кореозид A (37) [38].
Моно-, ди- и трисульфатированные пентасахаридные разветвленные углеводные цепи выделенных соединений были типичными для гликозидов голотурий рода Cucumaria [34]. В то же время единственный голостановый гликозид, выделенный из голотурии C. conicospermium – это монос ульфатированный кук умариозид А 2 -5 (39). Нег о л о станов ые трисульфатированные гликозиды 37 и 38, и дисульфатированные 40 и 41 представляли собой пары изомеров по положению двойной связи в ядре.
Установление структур тритерпеновых гликозидов голотурии Colochirus robustus
Гликозидный состав голотурии Colochirus robustus, собранной в 2012 г в прибрежных водах Вьетнама, изучался впервые. В общей сложности из C. robustus было выделено 15 тритерпеновых гликозидов, 6 из них были идентифицированы с известными соединениями на основе спектроскопических данных. Среди таких гликозидов были: гемиоедемозиды А (52) и В (53), ранее найденные в Hemioedema spectabilis [43], виолацеузиды А (80) и В (83) из Pseudocolochirus violaceus [60] и лефевреозид С (45) из Aslia lefevrei [40] и P. violaceus [150], выделенные из представителей семейства Cucumariidae, отряда Dendrochirotida, а также неотионидиозид (100), найденный впервые в голотурии Massinium (=Neothynidium) magnum семейства Phyllophoridae, отряд Dendrochirotida [66].
Остальные 9 соединений – колохирозиды А1 (153), А2 (154), A3 (155), B1 (156), B2 (157), B3 (158), C (159), D (160) и Е (161) – были новыми [151, 162, 163]. Структуры новых соединений устанавливались на основе комплексного анализа данных ЯМР спектроскопии (1Н, 13С, 1D TOCSY, COSY, HSQC, HMBC, ROESY) и масс-спектрометрии высокого разрешения HR ESI MS. Эти гликозиды различались строением углеводных цепей (их было 5 типов) и агликонов, которые принадлежали как к голостановому (8 гликозидов), так и к неголостановому рядам (колохирозид Е (161)). Соединения 153–160 характеризовались наличием голостановых агликонов и тетрасахаридных углеводных цепей, различавшихся по ряду признаков:
по второму моносахаридному остатку: хиновоза в колохирозидах группы В (156– 158) и колохирозиде С (159) или глюкоза в колохирозидах группы А (153–155) и колохирозиде D (160);
по третьему моносахаридному остатку: ксилоза в колохирозидах групп А (153– 155), В (156–158) и колохирозиде С (159) или глюкоза в колохирозиде D (160);
по положению сульфатной группы: при С-4 первой ксилозы в колохирозидах групп А (153–155) и В (156–158) или при С-6 глюкозы (третьего остатка в цепи) в колохирозиде D (160);
по количеству сульфатных групп: моносульфатированные колохирозиды групп А (153–155), В (156–158) и колохирозид D (160) или дисульфатированный колохирозид С (159).
Колохирозид Е (161) обладает очень необычной структурой по сравнению с другими гликозидами голотурий и имеет неголостановый агликон и трисахаридную сульфатированную углеводную цепь.
Колохирозид А1 (153)
В 1Н ЯМР спектре колохирозида А1 (153) наблюдались 4 дублета аномерных протонов при 4.70–5.18 м.д. (J = 7.7–7.9 Гц), которые были связаны в HSQC спектре с сигналами аномерных атомов углерода при 104.1–104.8 м.д. (табл. 26, стр. 117). Эти данные указывали на присутствие 4 моносахаридных остатков в углеводной цепи 153 и -конфигурации гликозидных связей [134].
Анализ COSY и 1D TOCSY спектров колохирозида А1 (153) показал, что его углеводная цепь состоит из остатков глюкозы, 3-О-метилглюкозы и двух остатков ксилозы. Хим. сдвиги первого остатка ксилозы свидетельствовали о его сульфатировании по положению С-4. Анализ спектров ROESY и НМВС показал, что остаток глюкозы находится во втором положении олигосахаридной цепи, а последовательность моносахаридных звеньев и положения гликозидных связей были характерны для известных ранее гликозидов (ROE- и HMBC корреляции между: Н-1 Xyl1 и H-3 (C-3) агликона, H-1 Glc2 и H-2 (C-2)Xyl1, H-1 Xyl3 и H-4 (C-4) Glc2, H-1 MeGlc4 и H-3 (C-3) Xyl3) (табл. 26, стр. 117).
Такая углеводная цепь была обнаружена ранее в составе виолацеузидов В (=филинопсид F) (83) и I (89) из P. violaceus [60, 61].
Агликонная часть спектра ЯМР 13С колохирозида А1 (153) содержала сигналы голостанового агликона с 7(8)- и 25(26)-двойными связями и 16-ацетоксигруппой (табл. 7, стр. 68). Такой агликон был обнаружен ранее в охотозидах А2-1 (135), В1–В3 (136–138) [140, 141] из Cucumaria okhotensis. Он встречается и во многих других гликозидах голотурий отряда Dendrochirotida [11, 23, 67, 72, 156].
Данные ЯМР спектроскопии для колохирозида А1 (153) подтверждались данными ESI MS масс-спектрометрии высокого разрешения. Так, в HR ESIMS (-) и (+) спектрах 153 присутствовали пики ионов [M - Na]- c m/z 1193.5065 (рассчитано m/z 1193.5055 для С55Н85О26S) и [M + Na]+ m/z 1239.4849 (рассчитано m/z 1239.4840 для С55Н85О26SNa2), на основе чего молекулярная формула 153 была определена как С55Н85О26SNa.
В ESI MS/MS (-) спектре наблюдались пики фрагментных ионов с m/z 1133.5 [M - Na -СН3СООН]", подтверждающий наличие ацетатной группы в 153 и с m/z 1075.5 [M - Na -SO4Na + Н] , соответствующий потере сульфатной группы. Последовательность моносахаридных звеньев в углеводной цепи 153 устанавливали на основе наличия ионных пиков с m/z: 1017.5 [M - Na - C7H13O5 (MeGlc) + Н] , 885.4 [M - Na - C7H13O5 - C5H8O4 (Xyl) + Н] , 723.4 [M - Na - C7H13O5 - C5H8O4 - С6Н10О5 (Glc) + Н] , 663.3 [M - Na -C7H13O5 - C5H8O4 - С6Н10О5 - СН3СОО]-. Другой путь фрагментации подтверждал структуру агликона, m/z: 681.2 [M - Na - C32H47O5 (Agl) - Н] , 505.2 [M - Na - C32H47O5 (Agl) - C7H13O5] , 373.1 [M - Na - C32H47O5 (Agl) - C7H13O5 - C5H8O4]- и 211.0 [M - Na -C32H47O5 (Agl) - C7H13O5 - C5H8O4 - С6Н10О5].
Таким образом, колохирозид А1 (153) представляет собой 16/?-ацетокси-3/?-0-[3-0-метил-/?-D-глюкопиранозил-(1 3)-/?-D-ксилопиранозил-(1 4)-/?-D-глюкопиранозил-(1 -2)-4-0-натрий сульфат-/?-D-ксилопиранозил]-голоста-7,25-диен.
Колохирозид А2 (154)
ЯМР спектры углеводных частей колохирозидов А2 (154) и А1 (153) полностью совпадали, указывая на наличие одинаковых олигосахаридных цепей в этих гликозидах (табл. 26, стр. 117).
Сигналы в ЯМР 13С и 1Н спектрах агликонной части колохирозида А2 (154) совпадали с соответствующими сигналами в спектрах кукумариозидов А2-4 (10) [25] и А7-3 (16) [27] из Cucumaria japonica, что свидетельствовало о присутствии голостанового агликона с 7(8)- и 25(26)-двойными связями без заместителей в полициклической системе или в боковой цепи (табл. 27, стр. 118). ROESY корреляции подтвердили типичное для тритерпеновых агликонов гликозидов голотурий пространственное строение агликона 154.
Молекулярная формула колохирозида А2 (154) была определена как С53Н83О24SNa на основе ESI MS (-) и (+) спектров высокого разрешения, где наблюдались пики ионов [M -Na] с m/z 1135.4998 (рассчитано m/z 1135.5000 для С53Н83О24S) и [M + Na]+ с m/z 1181.4802 (рассчитано m/z 1181.4785 для С53Н83О24SNa2), соответственно. Наличие сульфатной группы и последовательность моносахаридных остатков в углеводной цепи 154 было подтверждено ESI MS/MS (+) спектром, в котором наблюдались фрагментные ионы c m/z: 1061.6 [M + Na - NaНSO4]+, 1005.5 [M + Na - C7H13O5 (MeGlc) + Н]+, 873.4 [M + Na -C7H13O5 - C5H8O4 (Xyl) + Н]+, 711.4 [M + Na - C7H13O5 - C5H8O4 - С6Н10О5 (Glc) + Н]+. Дополнительный путь фрагментации подтверждал структуру агликона, он был связан с ионами с m/z: 745.2 [M + Na - C30H45O2 (Agl) + Н]+, 569.1 [M + Na - C30H45O2 - C7H13O5 +Н]+, 437.1 [M + Na - C30H45O2 - C7H13O5 - C5H8O4 + Н]+.
Эти данные однозначно указывали на то, колохирозид А2 (154) представляет собой 3/?-0-[3-0-метил-/?-D-глюкопиранозил-(1 3)-/?-D-ксилопиранозил-(1 4)-/?-D-глюкопиранозил-(1 2)-4-0-натрий сульфат-/?-D-ксилопиранозил]-голоста-7,25-диен.
Колохирозид А3 (155)
Колохирозид А3 (155) имеет такую же углеводную цепь, как описанные выше колохирозиды А2 (154) и А1 (153) (табл. 26, стр. 117).
Сигналы, соответствующие полициклическим системам агликонов в ЯМР 13С и 1Н спектрах колохирозидов А3 (155) и А2 (154), имели одинаковые значения хим. сдвигов. В спектрах этих соединений различались только сигналы боковых цепей, и в ЯМР 13С спектре 155 наблюдались сигналы, характерные для 24(25)-двойной связи (табл. 28, стр. 119), указывая на то, что колохирозиды А3 (155) и А2 (154) являются изомерами по положению двойной связи в их боковых цепях. 2D ЯМР спектры подтверждали структуру агликона колохирозида А3 (155), который был идентичен агликонам фрондозидов В (19) [30] и А7-2 (33) [37] из Cucumaria frondosa.
Молекулярная формула колохирозида А3 (155) была определена как С53Н83О24SNa и совпадала с формулой колохирозида А2 (154). В ESI MS (-) и (+) спектрах высокого разрешения имелись пики ионов [M - Na] с m/z 1135.4994 (рассчитано m/z 1135.5000 для С53Н83О24S) и [M + Na]+ с m/z 1181.4788 (рассчитано m/z 1181.4785 для С53Н83О24SNa2), соответственно. ESI MS/MS (-) спектр подтверждал последовательность моносахаридных остатков в углеводной цепи 155 благодаря наличию ионов с m/z: 959.4 [M - Na - C7H13O5 (MeGlc) + Н] , 827.4 [M - Na - C7H13O5 - C5H8O4 (Xyl) + Н] , 665.3 [M - Na - C7H13O5 -C5H8O4 - С6Н10О5 (Glc) + Н] Структура агликона была подтверждена наличием иона с m/z: 681.2 [M - Na - C30H45O3 (Agl) - Н]
Следовательно, колохирозид А3 (155) представляет собой 3/?-0-[3-0-метил-/?-D-глюкопиранозил-(1 - 3)-/?-D-ксилопиранозил-(1 - 4)-/?-D-глюкопиранозил-(1 - 2)-4-0-натрий сульфат-/?-D-ксилопиранозил]-голоста-7,24-диен.
Установление структур гликозидов голотурии Cladolabes schmeltzii
Голотурия Cladolabes schmeltzii (Sclerodactylidae, Dendrochirotida), собранная в заливе Ня-Чанг Южно-Китайского моря, является третьим химически изучавшимся видом рода Cladolabes. К моменту его изучения были известны структуры двух гликозидов – кладолозидов А (120) и В (121) – из голотурий Cladolabes sp. и C. bifurcatus, собранных у побережья острова Занзибар [81].
Из C. schmeltzii выделены 40 новых гликозидов и идентифицирован голотоксин А1 [44], имеющий такой же агликон как кладолозиды А (120) и В (121). Однако, сами соединения 120 и 121 не были найдены в гликозидной фракции C. schmeltzii. Выделенные гликозиды принадлежали к 19 группам (A–R), которые различались строением углеводных цепей, 12 из них оказались новыми. В пределах каждой группы гликозиды отличались друг от друга строением агликонов. Структуры новых соединений устанавливались на основе комплексного анализа данных ЯМР спектроскопии (1Н, 13С, 1D TOCSY, COSY, HSQC, HMBC, ROESY) и масс-спектрометрии высокого разрешения (HR ESI MS и MALDI TOF MS).
Кладолозиды группы А
13С ЯМР спектры углеводных цепей кладолозидов А 1 –А5 (203–207) совпадали друг с другом, а также со спектром углеводной части кладолозида А (120) [81], указывая на наличие одинаковых олигосахаридных фрагментов в молекулах гликозидов данной группы. Однако, строение углеводной цепи соединений 203–207 было впервые подтверждено комплексом современных спектроскопических методов. Установление структуры углеводной цепи гликозидов 203–207 описывается на примере кладолозида А1 (203) [199].
В 1Н ЯМР спектре кладолозида А1 (203) присутствовали 4 дублета аномерных протонов при 4.81–5.27 м.д. (J = 7.2–8.0 Гц), которые были связаны в HSQC спектре с сигналами аномерных атомов углерода при 105.1–105.6 м.д. (табл. 68, стр. 217). Эти данные указывали на наличие 4 моносахаридных остатков в углеводной цепи 203 и -конфигурацию гликозидных связей [134].
Анализ COSY и 1 D TOCSY спектров кладолозида А 1 (203) показал, что его углеводная цепь состоит из двух остатков ксилозы, остатков хиновозы и 3-О-метилглюкозы. Абсолютная D-конфигурация моносахаридных остатков в углеводных цепях кладолозидов разных групп была установлена с помощью гидролиза суммарной гликозидной фракции C. schmeltzii, последующего гликозилирования суммы моносахаридов R-(-)-2-октанолом, ацетилирования и ГЖХ анализа полученных ацетатов (–)-2-октилгликозидов совместно с аналогичными производными стандартных моносахаридов [200].
Сульфатные группы в углеводной цепи кладолозида А1 (203) отсутствовали. Анализ спектров ROESY и НМВС (табл. 68, стр. 217) позволил установить последовательность моносахаридных остатков и положения гликозидных связей в углеводной цепи 203 (наблюдавшиеся ROE- и НМВС- корреляции: Н-1 Xyl1 и H-3 (C-3) агликона, H-1 Qui2 и H-2 (C-2) Xyl1, H-1 Xyl3 и H-4 (C-4) Qui2, H-1 MeGlc4 и H-3 (C-3) Xyl3).
Таким образом, кладолозиды А1–А5 (203–207) имели линейные несульфатированные тетрасахаридные углеводные цепи и содержали ксилозу в качестве третьего моносахаридного остатка. Такие углеводные цепи были найдены ранее в составе теленотозида А из голотурии Thelenota ananas [201], представителя отряда Synallactida, и лефевреозида А 1 (42) из Aslia lefevrei [40], представителя отряда Dendrochirotida.
Кладолозид А1 (203)
В ЯМР спектрах агликонной части кладолозида A1 (203) наблюдались сигналы, соответствующие 18(20)-лактону, 9(11)-двойной связи и двум O-ацетатным группам (табл. 69, стр. 218). Положение одной O-ацетатной группы при C-16 было установлено на основании HMBC корреляции H-16/OCOCH 3 -16. Положение второй O-ацетатной группы при С-22 было установлено на основании сдвигов сигналов C-22 и Н-22 в область слабого поля 13C ЯМР и 1H ЯМР спектрах, соответственно. Сигнал Н-22 коррелировал в HMBC с сигналами C: 20, 21, OCOCH3-22; а в ROESY – с сигналами H-16, H-17, H-24, OCOCH3-16. Кроме того, сигнал H-24 коррелировал с сигналом OCOCH3-22 в ROESY спектре, что также подтверждало структуру боковой цепи агликона кладолозида A1 (203). Таким образом, агликон 203 представляет собой 16,22-диацетоксиголост-9-ен-3-ол.
В MALDI TOF (+) масс-спектре высокого разрешения кладолозида А і (203) присутствовал пик иона [М + Na]+ при m/z 1181.5730 (рассчитано m/z 1181.5714 для Cs7H9o024Na). Молекулярная формула 203 была определена на основании этих данных и 13С ЯМР спектра как С57Н90О24. Последовательность моносахар ид ных звеньев в углеводной цепи 203 подтверждалась наличием в MALDI TOF MS/MS (+) масс-спектре фрагментных ионов с m/z: 1005.5 [М + Na - С7Н13О5 (MeGlc) + Н]+, 873.5 [М + Na - С7Н13О5 - С5Н8О4 (Xyl) + Н]+, 727.5 [М + Na - С7Н13О5 - С5Н8О4 - СбНю04 (Qui) + Н]+, 595.4 [М + Na - С7Н13О5 -С5Н8О4 - С6Н10О4 - С5Н8О4 +Н]+. Фрагментные иоиы с m/z: 1121.6 [М + №-СНзСООН]+, 1079.5 [М + Na - СН3СОО - СОСНз]+ демонстрировали последовательный отрыв двух О-ацетатных групп.
Таким образом, кладолозид А і (203) является 16Д22 -диацетокси-3/?-0-[3-0-метил-/?-О-глюкопиранозил-(1 - 3)-/?-Б-ксилопиранозил-(1 - 4)-/?-Б-хиновопиранозил-(1 —»2)-/?-D-ксилопиранозил] -голост-9-еном.
Кладолозид А2 (204)
Агликонная часть ЯМР 13С спектра 204 была очень похожа на спектр агликона кладолозида Ai (203) и отличалась только присутствием сигналов терминальной двойной связи (табл. 70, стр. 219). НМВС-корреляции Н-26/С-24, Н-26/С-27, Н-27/С-24, Н-27/С-25, Н-27/С-26 и ROE-корреляции Н-26/Н-24, Н-27/Н-22, Н-27/Н-26, Н-22/Н-24 подтверждали структуру боковой цепи 204, что позволило установить структуру агликона кладолозида А 2 (204) как 16Д22 -диацетоксиголоста-9,25-диен-ЗД-ола.
В MALDI TOF (+) масс-спектре высокого разрешения кладолозида А 2 (204) имелся пик иона [М + Na]+ при m/z 1179.5590 (рассчитано m/z 1179.5558 дляС57Н88 0г4№). Молекулярная формула 204 была определена на основании этих данных и 13С ЯМР спектра как С57Н88О24. Последовательность моносахаридных звеньев в углеводной цепи 204 была подтверждена наличием в MALDI TOF MS/MS (+) спектре фрагментных ионов с m/z: 1003.5, 871.5, 725.4, 593.3 (см. Экспериментальную часть), которые были аналогичны пикам в спектре 203. Пики фрагментных ионов при m/z: 1119.6 [М + Na - СНзСООН]+, 1077.5 [М + Na - СН3СОО -СОСНз]+, 1059.5 [М + Na - 2СНзСООН]+ демонстрировали последовательный отрыв двух О-ацетатных групп. Фрагментные ионы с m/z 943.5 [М + Na - СН3СОО - С 7Н13 О 5], 811.4 [М + Na - СН3СОО - С7Н13О5 - С5Н8О4] , 665.3 [М + Na - СНзСОО - С7Н13О5 - С5Н8О4 -СбНю04]+, 533.0 [М + Na - СНзСОО - С7Н13О5 - С5Н8О4 - СбШо04 - CsH804]+ указывали на отрыв ацетокси-группы с последующим отрывом моносахаридных звеньев.
Полученные данные указывали на то, что кладолозид A 2 (204) является 16Д,22 -диацетокси-3/?-0-[3-0-метил-/?-D-глюкопиранозил-(1 3)-/?-D-ксилопиранозил-(1 4)-/?-D-хиновопиранозил-(1 -2)-/?-D-ксилопиранозил]-голоста-9,25-диеном.
Кладолозид А3 (205)
Сравнение 13C ЯМР спектров агликонов кладолозидов A3 (205) и A2 (204) показало идентичность их полициклических систем и отличия в хим. сдвигах сигналов, относящихся к боковым цепям (табл. 71, стр. 220). Анализ COSY спектра 205 позволил установить последовательность протонов боковой цепи от Н-22 до Н-26, которая указывала на отсутствие О-ацетатной группы в боковой цепи гликозида 205 и на наличие терминальной двойной связи. Структура боковой цепи была подтверждена HMBC корреляциями: H-24/C: 22, 23, 25, 26; H-26/C: 24, 27 и H-27/C: 24, 25, 26. Таким образом, агликон кладолозида A3 (205) представляет собой 16/?-ацетоксиголоста-9,25-диен-3/?-ол, он впервые найден в гликозидах голотурий.
В MALDI TOF (+) масс-спектре высокого разрешения кладолозида A3 (205) наблюдался пик иона [M + Na]+ при m/z 1121.5530 (рассчитано m/z 1121.5503 для C55H86 O 22Na), на основании чего молекулярная формула 205 была определена как C 55 H 86 O 22. Последовательность моносахаридных звеньев в углеводной цепи 205 подтверждалась наличием в MALDI TOF (+) масс-спектре фрагментных ионов с m/z: 945.4, 813.3, 667.3 (см. Экспериментальную часть). Фрагментный ион [M + Na - CH3COOH]+ с m/z 1061.5 свидетельствовал об отрыве О-ацетатной группы и подвергался дальнейшей фрагментации, m/z: 885.4 [M + Na - CH3COO - С7H13О5 (MeGlc)]+, 753.4 [M + Na - CH3COO - С7H13О5 -С5H8О4 (Xyl)]+, 607.3 [M + Na - CH3COO - С7H13О5 - С5H8О4 - С6H10О4 (Qui)]+. Пик иона с m/z 6273 соответствовал отрыву агликона [M + Na - С32H47О4 (Agl) + H]+, тем самым подтверждая структуру 205.
Таким образом, кладолозид A3 (205) является 16/?-ацетокси-3/?-0-[3-0-метил-/?-D-глюкопиранозил-(1 - 3)-/?-D-ксилопиранозил-(1 - 4)-/?-D-хиновопиранозил-(1 - -2)-/?-D-ксилопиранозил]-голоста-9,25-диеном.
Биосинтетические трансформации агликонов тритерпеновых гликозидов голотурий
Как известно, голотурии и губки являются единственными группами животных, синтезирующими тритерпеновые гликозиды, которые долгие годы считались метаболитами исключительно высших наземных растений. Особенности биосинтеза данного класса соединений в голотуриях, гораздо менее изучены, по сравнению с биосинтезом тритерпеноидов в растениях. Однако уже сейчас на основании строения этих веществ можно сделать заключение, что их биосинтез относится к самым сложным примерам биосинтеза вторичных метаболитов. В самом деле, тритерпеновые полициклические системы синтезируются оксидосквален циклазами различной специфичности, по-видимому, с необычными аминокислотными последовательностями. Дальнейшие окислительные трансформации агликонов после образования их тетрациклических предшественников осуществляются цитохром-зависимыми монооксигеназами (CYP450s). Обе группы этих ферментов практически не изучены в голотуриях. Биосинтез углеводных цепей осуществляется большим набором гликозилтрансфераз. В отличие от гликозидов наземного происхождения, гликозиды морских организмов часто имеют сульфатные группы, а, следовательно, биосинтезируются с участием сульфатаз. Терминальные моносахариды их углеводных цепей, как правило, метилированы под действием метилаз.
Биосинтез обычно изучают с применением веществ-предшественников, несущих радиоактивный или стабильный изотоп («метку»), которые вводятся в организм продуцента. Через некоторое время выделяют целевое вещество и анализируют включение в него «метки». Однако масштабное применение этого подхода к гликозидам голотурий затруднительно по ряду причин. Во-первых, это требует осуществления сложных синтезов несущих метку потенциальных предшественников. Во-вторых, плохо изучена сезонная динамика биосинтеза, т.к. голотурии биосинтезируют эти вещества не постоянно, а на определенных этапах своего развития и в зависимости от условий среды. Практически отсутствуют данные о клетках, органах или частях тела голотурий, в которых протекает биосинтез тритерпеновых гликозидов. Ранее проведенные исследования по включению радиоактивной метки из предполагаемых предшественников в агликоны гликозидов давали неоднозначные результаты. Тем не менее, были сделаны выводы о возможности биосинтеза агликонов через ланостерин (в таком случае биосинтезируются гликозиды с 7(8)-двойной связью в агликонах [123]) или паркеол (в этом случае накапливаются гликозиды, содержащие 9(11)-двойную связь в ядре агликона [126]).
Другой способ изучения биосинтеза не менее сложен. Он заключается в выделении ферментов биосинтеза и изучении катализируемых ими превращений на модельных соединениях. В последние годы в современной науке все шире применяются геномные, транскриптомные, протеомные исследования для изучения биосинтеза вторичных метаболитов. Так, при изучении геномов двух видов голотурий – Aposichopus japonicus и Stichopus horrens – впервые были обнаружены гены оксидосквален циклаз голотурий и установлены их нуклеотидные последовательности [127, 131]. Однако, более существенный вклад в изучение биосинтеза тритерпеновых гликозидов голотурий будет внесен только тогда, когда эти ферменты, обеспечивающие циклизацию 2,3-оксидосквалена в тритерпеновые спирты – предшественники гликозидов, будут выделены и охарактеризованы.
Наконец, еще один из подходов, который применялся в данной работе, состоит в выделении как можно большего числа гликозидов и установлении их строения. В числе выделенных соединений обнаруживаются и минорные промежуточные (или «горячие») метаболиты, которые обычно не накапливаются, поскольку быстро превращаются в другие продукты биосинтеза. Сравнительный анализ структур выделенных соединений позволяет проследить биогенетические взаимосвязи, отражающие последовательность трансформаций, ведущих к биосинтезу конечных продуктов. Голотурии Synapta maculata, Eupentacta fraudatrix, Cladolabes schmeltzii, Сucumaria fallax и изученная нами ранее Cucumaria frondosa представляются удобными объектами для реконструкции некоторых стадий биотрансформаций агликонов, т.к. либо характеризуются большим разнообразием агликонов, либо содержат агликоны с необычными структурными фрагментами. Анализ биогенеза таких агликонов позволил выявить закономерности, характерные для биосинтеза агликонов гликозидов голотурий в целом.
Как уже говорилось выше, тритерпеновые гликозиды голотурий являются продуктами биосинтеза мозаичного типа. Мозаичность проявляется на уровне молекул гликозидов в целом, т.к. агликоны и углеводные цепи биосинтезируются параллельно и независимо друг от друга. При этом в составе молекул гликозидов могут сочетаться агликоны с разной степенью окисленности, несущие в разной степени «развитые» углеводные цепи, или же разные агликоны могут быть скомбинированы с одинаковыми углеводными фрагментами. Гликозиды, которые содержат одинаковые по строению углеводные цепи, как правило, относят к определенной группе, относительно легко выделяемой хроматографическими методами из гликозидной фракции одного вида голотурий. Примерами видов, содержащих несколько групп гликозидов, являются E. fraudatrix, C. schmeltzii, C. robustus, M. magnum и представители рода Cucumaria. В составе одной группы могут присутствовать гликозиды как с голостановыми, так и с неголостановыми агликонами.
Кроме того, мозаичность биосинтеза гликозидов заключается и в том, что одни и те же агликоны или углеводные цепи могут быть синтезированы разными путями. Так, в E. fraudarix одинаковые углеводные цепи могут образовываться несколькими путями из-за сдвига по времени друг относительно друга стадий гликозилирования и сульфатирования (рис. 14, стр. 209). Последовательность стадий окисления различных положений полициклических систем и модификаций боковых цепей агликонов также может изменяться, что приводит к синтезу агликонов с 18(20)-, 18(16)-лактоном или без лактона, с различными боковыми цепями или без них. Схемы биосинтеза агликонов C. fallax (рис. 4, стр. 146), C. schmeltzii (рис. 17, стр. 283), M. magnum (рис. 20, стр. 304) демонстрируют возможность сдвига по времени относительно друг друга указанных трансформаций агликонов. Таким образом, проявление мозаичности биосинтеза гликозидов можно наблюдать и на уровне отдельных частей их молекул.
В гликозидах голотурий преобладают голостановые агликоны (с 18(20)-лактоном), тогда как неголостановые агликоны (без лактона или с 18(16)-лактоном) встречаются не так часто. В полициклических системах агликонов двойные связи чаще занимают положения 7(8)- или 9(11)-, гораздо реже встречаются гликозиды с 8(9)-двойной связью в ядре. До последнего времени, вопрос о биосинтетических предшественниках (продуктах циклизации 2,3-оксидосквалена) агликонов с различным положением двойной связи в ядре оставался открытым. Характерным структурным признаком агликонов гликозидов голотурий с 7(8)-двойной связью является нетипичная для гликозидов растений или губок 9-Н конфигурация. Единственным исключением – соединением, найденным в одном из видов растений, является абиеслактон – тритерпеноид, содержащий 9-Н-ланоста-7(8)-еновый фрагмент, но не имеющий лактона в полициклической системе [221]. Вопрос о том, как данная структурная особенность связана с функционированием оксидосквален циклаз голотурий пока остается без ответа.
Оксидосквален циклазы являются первым источником разнообразия тритерпеновых скелетных систем, т.к. они осуществляют циклизацию 2,3-оксидосквалена через стадии образования карбокатионов, их перегруппировок и последующего отщепления протона из определенных положений полициклической системы, в различные тритерпеновые продукты. В связи с этим, становится очевидным, что необычная 9-Н конфигурация в 7(8)-ненасыщенных агликонах гликозидов голотурий формируется на ранних стадиях биосинтеза агликонов и является результатом стабилизации ланостерил 8-катиона и последующего депротонирования метиленовой группы в положении 7 с сохранением высокоэнергетических конформаций циклов В и С. Продуктом данного ферментативного процесса является 9-Н-ланоста-7,24-диен-3-ол – ключевой предшественник агликонов гликозидов с 7(8)-двойной связью (рис. 21, стр. 317). Именно это соединение являлось продуктом, обнаруженным при экспрессии в дрожжах одного из генов оксидосквален циклаз, найденных в голотурии A. japonicus, продуктом экспрессии второго гена был паркеол [127]. Действительно, подавляющее большинство гликозидов, выделенных из этого вида, содержит агликоны с 9(11)-двойной связью [6, 44], которые являются продуктами биосинтетических трансформаций паркеола, но один из известных гликозидов – стихлорозид С1 – найденный в гликозидной фракции A. japonicus [222], характеризуется наличием 7(8)-двойной связи в полициклической системе. Дополнительным подтверждением тому, что именно 9-Н-ланоста-7,24-диен-3-ол является биосинтетическим предшественником агликонов 7(8)-серии, служат гликозиды 31, 35, 36 из C. frondosa, содержащие его производные в качестве агликонов [31, 36, 37].
Недавние исследования показали, что гены оксидосквален циклаз голотурии A. japonicus содержат многочисленные растительно-подобные мотивы, чем значительно отличаются от ланостерол синтаз других групп животных [127]. Как считают авторы исследования, именно изменение продуктов циклизации 2,3-оксидосквалена у голотурий в процессе эволюции обусловило появление их системы химической защиты в виде тритерпеновых гликозидов.
Такой же продукт циклизации 2,3-оксидосквалена (9-Н-ланоста-7,24-диен-3-ол) был обнаружен в растении Arabidopsis thaliana. При сравнении аминокислотных последовательностей двух нативных оксидосквален циклаз из данного растения – циклоартенол синтазы и ланостерол синтазы – было обнаружено, что различия в их каталитических центрах заключались всего в одном аминокислотном остатке. Путем направленного мутагенеза из A. thaliana была выделена мутантная циклоартенол синтаза, которая катализировала циклизацию 2,3-оксидосквалена в три основных продукта: 9-Н-ланоста-7,24-диен-3-ол, ланостерин и паркеол [223]. Таким образом, направленная замена одной аминокислоты в активном центре нативной циклоартенол синтазы приводила к изменению профиля продуктов, одним из которых становился 9-Н-ланоста-7,24-диен-3-ол. Недавние исследования оксидосквален циклаз растений показали, что результатом работы фермента, как правило, является не один конкретный продукт реакции, а некоторый набор метаболитов, один из которых преобладает [129]. Данное обстоятельство является чрезвычайно важным и выгодным для эволюции, т.к. позволяет ферментам оперативно изменять спектр конечных продуктов в зависимости от “требований” отбора или факторов внешней среды (путем регуляции активности фермента, в результате которой может быть преимущественно синтезирован тот или иной конечный продукт).