Содержание к диссертации
Введение
1. Методы синтеза модифицированных ретиналеи 7
1.1. Основные методы синтеза ретиноидов 12
1.2. Получение аїї-Е- и ІЗІ-изомеров ретиналя 13
1.3. Модификация полиеновой цепи ретиналеи 17
1.3.1. Получение дезметильных и полиметильных аналогов ретиналя 17
1.3.2. Синтез галогенсодержащих аналогов ретиналя 21
1.3.3. Синтез эпоксиретиналей 23
1.3.4. Синтез дигидроретиналей 24
1.3.5. Синтез аналогов ретиналя с фиксированными конформациями полиеновой цепи 27
1.4. Синтез ретиналеи, модифицированных по триметилциклогексеновому кольцу 30
1.4.1. Получение ретиналеи с модифицированным триметилциклогексёновым кольцом 30
1.4.2. Синтез аналогов ретиналя, замещенных по С/ 4) -атому 36
1.4.3. Ароматические аналоги ретиналя 38
1.4.4. Синтез ациклических аналогов ретиналя 40
1.4.5. Спинмеченые аналоги ретиналя 41
1.4.6. Фотоаффинномеченые аналоги ретиналя 42
1.5. Смешанная модификация молекулы ретиналя 44
2. Обсуждение результатов 48
2.1. Синтез 6Е- и 62-изомеров (2Е)-2,6-диметил-8- трифенилсилилоксиокта-2,6-диен-4-ин-І-аля 53
2.2. Синтез изомерных 11,12-дегидроретинолов и их аналогов 59
2.2.1. Синтез фосфониевых солей 60
2.2.2. Синтез 11,12-дегидроретинолов и их аналогов олефинированием по Виттигу 62
2.3. Синтез IIZ- и ISZ-ретиналей 70
2.4. Синтез ароматических аналогов 13г-ретиналя 72
3. Экспериментальная часть 80
Выводы 110
- Получение аїї-Е- и ІЗІ-изомеров ретиналя
- Синтез ретиналеи, модифицированных по триметилциклогексеновому кольцу
- Синтез изомерных 11,12-дегидроретинолов и их аналогов
- Синтез ароматических аналогов 13г-ретиналя
Получение аїї-Е- и ІЗІ-изомеров ретиналя
Для получения соединений аП-Е-ряда был предложен и реализован в промышленном масштабе ряд схем ( см., например, Г28-ЗІІ ). В настоящее время аП-Е-ретиналь (2) является коммерчески доступным соединением. Единственный известный синтез его I3Z-H30Mepa (5) описан Мацуи [38,39] , который обнаружил, что стереонаправленноеть конденсации Е-изомера jS-ионилиденуксусного альдегида (6) с этиловым эфиром , -диметилакриловой кислоты (7) существенно зависит от природы используемого основания: в случае амида калия образуется соединение (8), имеющее ІЗЕ-связь, в то время как применение амидов лития или натрия приводит к 132-производным (9,10,5) Гз8,39 J ( схема 2 ). Однако данный метод синтеза соединений с 13г-конфигурацией двойной связи является малоэффективным. В связи с развитием в последние годы новых приемов разделения близких по структуре веществ ( в первую очередь, метода ВЭЖХ ) [40 ] и с учетом того, что для изучения взаимодействия апобелков с различными изомерами ретиналя и исследования свойств образующихся пигментов необходимы незначительные количества этих веществ, создалась возможность отказаться от направленных, достаточно трудоемких методов их синтеза в пользу следующего подхода: синтезируют наиболее простым способом один из изомеров ( возможно и их смесь ) ретиналя или его аналогов и полученное вещество подвергают фотоизомеризации . Наиболее эффективно процесс протекает при освещении светом ртутной лампы высокого давления растворов рети-наля в полярных растворителях, например, в ацетонитриле. Образующуюся в результате смесь изомеров разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ. В качестве примера, наглядно иллюстрирующего данный методический подход, следует привести работу японских авторов 41 I в которой в результате фотоизомеризации аП-Е-ретиналя (2) получен набор его стереоизомеров ( рис. I и табл. 2 ). В последнее время кроме фотоизомеризации часто используют изомеризацию под действием различных реагентов. Так, Рандо были исследованы превращения аП-Е-ретиналя под действием иода и три-фторуксусной кислоты. Оба реагента приводили к смеси I3Z- и 9Z-pe-тиналей, с преобладанием первого изомера [43 ] . Рассмотренный выше методический прием - сочетание направленной изомеризации с препаративной БЭЖХ получил широкое распространение в синтезах различных стереоизомеров ретиналя и его аналогов.
Получение дезметилъных и полиметилъных аналогов ретиналя. Дезметильные аналоги ретиналя (11,12,13) были синтезированы Остерхельтом [44,45] по схеме, предложенной Ван ден Темплем для получения соответствующих аналогов ацетата витамина А [46 ] ( схема 3 ). Альдегид (I4,R=H), синтезированный в три стадии из доступного jg-ионона (I5,R=CHg), вводили в конденсацию по Хорнеру с фосфонатом (I6,R=H). Образующийся при этом эфир триеновой кислоты ( на схеме не показан ) переводили по методу А - восстановление литийалюмогидридом (LAH ) или диизобутилалюмогидридом ( DIBAL ) до соответствующего спирта и окисление последнего активным диоксидом марганца - в альдегид (I7,R=R=H), который олефинировали по Хорнеру фосфонатами (I8,R?=CHg) или (I9,R =Н) и с использованием метода А трансформировали в альдегиды (II,R=R =R=H, R =CHg) и (I3,R=R =R =R3=H). Аналогично из -ионилиденуксусного альдегида (6,R=CH3, R=H) и фосфоната (I9,R =Н) было получено соединение (I2,R=CHg, R R R H). Альтернативный путь синтеза дезметильных аналогов ретиналя (11-13) был предложен Люгтенбургом 147,481 ( см. схему 3 ). Он был основан на схеме Ci5+%=C90 разработанной Поммером для получения ацетата витамина А [491 . Олефинирова-ние по Виттигу фосфониевых солей (20,В=Н) или (2I,R=CHg) синтона-ми (22,R =H) или (23,5r=CHcj) приводило к смеси аП-Е- и IIZ-рети-нилацетатов ( соотношение Е /Z,0,8 ), которые по методу Б - омыление до соответствующих спиртов и окисление активным диоксидом марганца - трансформировали в смесь аЛ-Е- и irz-изомеров аналогов ретиналя (11-13), последние разделяли с помощью ВЭЖХ. Полученные соединения аП-Е-ряда были исследованы далее в реакции ресинтеза с БО (см. табл. In ). Причем,авторами работ [45,48] получены различные данные о протонотранслирующей способности 9,13-дидезметиль-ного аналога БР, в то же время было установлено, что удаление ІЗ-СНд-грушш в молекуле хромофора приводит к уменьшению протонотранслирующей способности на два порядка, по сравнению с натив-ным БР.
Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что 13-СНд-группа играет ключевую роль в процессе ІЗЕ — - I3Z-H30-меризации хромофорной группы БР ( что соответствует %i2" 0- -BPggg - переходу в его фотоцикле ) и тем самым создает условия для эффективного транспорта протонов. Для получения полиметильных аналогов Наканиси разработал стереоспецифичный метод синтеза 10-метшг-, 14-метил-, 10,14-ди-метилретиналей (24-26) [501 (схема 3 ). Рассмотрим этот подход на примере синтеза 10,14-диметилретиналя (26tR=R=R =R=CHg ). Конденсацией -ионона (I5,R=CHg ) с литиевым производным пропи-лиденциклогексиламина (27,R=CHg) была получена смесь Z- (29) и Е- (30) изомеров альдегида (R=R=CHg), которую разделяли хромато-графически. Далее следовали стадии: альдольная конденсация Е-изо-мера (30,R=R =CHg) с ацетоном в присутствии едкого натра, которая приводила к кетону (3I,R=R =R2=CHg) с выходом 82 и повторная кон-денсация с литиевым производным (27,R=CHg). В результате получали смесь 133- и аП-Е-изомеров 10,14-диметилретиналя (33,26) с общим выходом 38$. По аналогичной схеме был осуществлен также синтез различных изомеров 10-метил- и 14-метилретиналей (24,25). Ранее этими же авторами был описан синтез ІЗ-дезметил-14-метил-ретиналя (34) по схеме, которая включала конденсацию альдегида С17 (35,E=CHg, R R H) по Хорнеру с фосфонатом (36,3=СНд) и последующее использование метода А [51J ( схема 3 ). С/уич молекулы хромофора из-за имеющихся пространственных затруднений лишает ее способности связываться с БО. Так,например, альдегид (34) образует с БО нековалентный комплекс ( Хмакс 430 нм) ус тойчивый в темноте, но не способный превращаться в хромопротеид Одним из подходов к анализу распределения зарядов вокруг ре-тинилиденовой группировки может быть использование аналогов ретиналя, имеющих различную электронную плотность в фиксированных местах молекулы, но при этом сохраняющих первоначальный размер хромофорной группы. Сравнение спектральных свойств исходного ре-тинилиденпротеида со свойствами такого искусственного пигмента позволяет сделать определенные выводы о локализации заряженных групп белка вблизи хромофора. Реализацией этого подхода, например, является введение в молекулу ретиналя электоотрицательных атомов галогенов. Кроме того, хромофорные группы, содержащие атомы; брома или иода, могли бы найти применение в качестве электроноплот-ных-меток для определения локализации хромофора внутри молекулы БР с помощью рентгеноструктурного анализа и дифракции нейтронов. С этой целью Наканиси с сотр. разработал и осуществил синтез 13-бром- (37) и 9-бромретиналей (38) по схеме 4 [52,53 J.
Синтез ретиналеи, модифицированных по триметилциклогексеновому кольцу
аП-Е-Изомер 3,4-дидегидроретиналя (101 а) был получен Ислером по схеме 10 , разработанной им ранее для синтеза ацетата витамина А (50) Гб5 ] , ключевая стадия которой заключается в конденсации 3,4-дидегидроальдегида j6-Cj4 (102) с реактивом Иоцича из Z-изо-мера ацетиленового карбинола (103), в результате которой с высоким выходом образуется 3,4-дидегидродиолин - С0 (Ю4). Последующим каталитическим гидрированием тройной связи до двойной диолин (104) превращали в этиленовый гликоль (105), который затем ацети-лировали по первичной Н0-группе для ее защиты при дальнейших превращениях. После чего моноацетат (106) подвергали аллильной перегруппировке с одновременной дегидратацией и полученный таким образом ацетат 3,4-дидегидроретинола (107) трансформировали в ре-тиналь А (101 а) через стадии омыления и окисления Мп02 [бб] . Используя метод Мацуи [38,3э] Швайтер осуществил синтез аП-Е- и І37-изомеров ретиналя А (101 а), исходя из Е-изомера 3,4-дидегидроальдегида С15 (108 а) (схема II ) [бб ] . Но наиболее удобным методом получения соединений А -ряда в настоящее время является дегидробромирование 4-бромретиналя(109), под действием третичных аминов ( см. с. 37 ). оС-Ретиналь (ІОІ б), использованный Остерхельтом для получения соответствующего пигмента на основе БО, был приготовлен, исходя из о-ионона (НО б), с применением двухкратной конденсации по Хорнеру с фосфонатами (III и 112). Первоначально был синтезирован Cj5 нитрил (на схеме не показан), который восстановлением с помощью DlBAb (метод В) превращали в od-альдегид Cjg (108 б), повторение операции олефинирования фосфонатом состава Cg (112) и трансформация нитрильной группы в альдегидную по методу В давало целевой о{-ретиналь (101 б) ( схема II ) [б7]. 5,6-Дигидроретиналь (101 в) был синтезирован по схеме II [_68,69 J . Реакцией триметилциклогексанона (ИЗ в) с хлорметил-этиловым эфиром по Гриньяру и последующим гидролизом 98% муравьиной кислотой получали 5,6-дигидроцитраль (114 в), конденсация которого с этиловым эфиром й, $-диметилакриловой кислоты (7) в присутствии амида калия в жидком аммиаке с последующим превращением по методу А приводила к 5,6-дигидроаналогу альдегида Cjg (108 в).
Повторение последовательности операций: конденсации с соединением (7), восстановления и окисления получали 5,6-дигидро-производное ретиналя (101 в). Синтез 5-дезметильного аналога ретиналя (101 г) был осуществлен Остерхельтом с сотр., исходя из соответствующего производного jS-ионона (НО г) с использованием последовательности реакций, которые были опробированы при синтезе о-ретиналя (101 б) Г45J . Пигмент, образованный Б0 и 5-дезметильным аналогом ретиналя (101 г) ( см. табл. In ) обладал способностью к транслокации протонов на уровне природного хромопротеида Г45,70І . Для получения 1,1,5-тридезметилъного- аналога ретиналя (101 д) циклогексен-1-аль (114 д) вводили в конденсацию с фосфонатом состава Ср; (112), нитрильную группу продукта реакции восстанавливали DIBAL до альдегидной и целевой альдегид (101 г) получали повторением указанной последовательности реакций 711 . 1.4.2, Синтез аналогов ретиналя. замещенных по G, м-атому. Для получения аналогов ретиналя, содержащих в положении С/4х алкильные и диметиламинный заместители (101 е-з ) был использован подход, основанный на аллильном бромировании К-бромсукцинимидом и последующем замещении атома брома в молекуле $-ионона (15) или его кеталя (115) ( схемы 11,12 ) [72,73J . Двухкратное наращивание цепи на С2 и С -фрагменты проводили оле-финированием по Хорнеру стандартными методами. Ранее Мицнером и Серебряным -был предложен более простой и удобный метод получения аналогов ретиналя (117 а-м), замещенных по С/ ч-атому ( схема 13 ) [74 J , непосредственным бромированием аП-Е-ретиналя (2) Н-бромсукцинимидом в тетрагидрофуране и последующем замещении атома брома на алкокси-, гидрокси-, ацилокси-, азидную и другие группы. С другой стороны, элиминирование брома в соединении (109) под действием стерически затрудненных третичных аминов, таких как фенилморфолин, DBN , DBU приводит с выходом По данному методу были синтезированы соединения (117 6-м ) [74] . 4-Кеторетиналь (117 а ) получали направленным окислением аП-Е-ре-тиналя (2) "кислой" формой Мп02 [_75,7б] . Еа основе реакции этих аналогов с БО был получен ряд искусственных пигментов, спектральные характеристики которых приведены в табл. In . Анализ их спектральных свойств позволяет отметить некоторые закономерности: а) введение заместителя по С/ л-атому триметилциклогексенового кольца вызывает значительный гипсохромный сдвиг в спектрах пигментов, по сравнению с нативным БР; это явление может быть объяснено в терминах модели "внешнего точечного- заряда" J_60 ]:возникающие сте-рические возмущения у С/л\-атома способствуют разделению дополни- тельного заряда в окрестности С/с\-атома и полиеновой цепи, б) по-видимому, вблизи С/д\-атома также имеется некая нуклеофильная группа БО, которая индуцирует гидролиз сложноэфирной связи в пигментах, полученных на основе соединений (117 з-л), что было зафиксировано по образованию из них пигмента, содержащего в качестве хромофорной группы 4-гидроксиретиналь (117 б) [74J 1.4.3. Ароматические аналоги ретиналя. Ароматические аналоги ретиналя (101 и-м) были синтезированы Наканиси с сотр. по схеме II ( см. с. 33 ) [52,77J , включающей двухкратное повторение операций: олефинирования по Хорнеру бензальдегида и его производных С -фосфонатом (18) с последующим использованием метода А. Индивидуальные изомеры соединений (101 и-м) были выделены ВЭЖХ. Лиу с сотр., применив аналогичный подход, получили ряд ароматических производных ретиналя (101 н-р). Схема II [78J . Альтернативный синтез фенилретиналя (101 и) был осуществлен в лаборатории Кораны ( см. схему II [79J ). Олефинирование по Бит-тигу бензальдегида илидом, генерированным из фосфониевои соли (118), приводило к соответствующему эфиру ретиноевои кислоты, из которого по методу А был получен фенилретиналь (101 и) с общим выходом 32%.
Умадэви опубликовал синтез аналога (119) по схеме 14 [80J . Для получения аналога (119) терефталевый альдегид подвергали оле-финированию С -фосфонатом (45), частичное восстановление образующегося альдегидоэфира борогидридом натрия с последующим введением тетрагидропиранильной защиты (ТНР) и обработка по методу А приводили к альдегиду (120) с выходом 72$. После повторения операции олефинирования и удаления тетрагидропиранильной защиты эте-рифицированный аналог ретиноевой кислоты (121) силилировали с одновременным замещением триметилсилилокси- группы на атом брома действием безводного бромида лития в ацетонитриле. После повторного применения метода А получали целевой альдегид (119), Актар синтезировал нафтилретиналь (122) по схеме 15 I 81 I Особенностью данного аналога является то, что у него копланарность положения кольцо - цепь жестко зафиксирована. Олефинированием jS-нафтилметилкетона (123) по Хорнеру фосфонатом (16) был получен эфир (124), который по методу А переводили в альдегид (125). Аль-дольной конденсацией последнего с ацетоном в присутствии I н. едкого натра был получен кетон (126), из которого повторением первых трех стадий был синтезирован аП-Е-изомер нафтилретиналя (122). Токунага с сотр. сообщил об образовании двух пигментов при инкубации этого аналога (122) с БО ( Л макс 442 и 503 нм ), причем образование того или иного пигмента зависело от количества добавлен- ного аналога ретиналя. Оба пигмента имели место связывания хромофора то же, что и в нативном БР, и сохраняли способность к транспорту протонов при освещении [82] . В настоящее время в литературе также дискутируется вопрос о положении Лмакс для фенильного аналога БР. Так авторы работы [78] считают, что регенерация аП-Е-изомера фенилретиналя (101 и) с БО приводит к образованию двух производных с различными Л шкс, но с другой стороны имеются данные об образовании либо коротковолнового производного Г52,77] , либо его длиноволновой формы [79,80J что, по-видимому,- связано как с методом приготовления апомембран, так и с ионной силой и рН используемого в качестве водной фазы буфера. Сохранение функциональной активности у пигментов на основе БО и фенильного или нафтильного аналогов ретиналя (101 и, 122) позволило окончательно исключить гипотезу о возможности возникновения ретро-ретинильных интермедиатов в процессе транспорта протонов в БР [79,81J.
Синтез изомерных 11,12-дегидроретинолов и их аналогов
В соответствии с намеченным планом синтезированные изомерные защищенные альдегиды (41,42) использовали далее в конденсации по Виттигу. Успех проведения такого превращения, в свою очередь, зависит как от надежности метода получения исходных фосфониевых солей, так и от особенностей взаимодействия генерированных из них илидов с карбонилсодержащим соединением. Поэтому нами исследованы эти вопросы в применении к синтезу ретиналей и их аналогов. 2.2.1. Синтез шосшониевых солей [СЙНТОН (Г) ] Для нахождения оптимального метода синтеза трифенилфосфониевых солей (23,48-59) (схема 26) нами были исследованы два варианта: - традиционный, заключающийся в кватернизации трифенилфосфина алкилбромидами различного строения (путь А), которые, в свою очередь, получали из соответствующих спиртов действием Вг или SOBr2. - второй (путь Б) - взаимодействие jg-циклогераниола и замещенных бензиловых спиртов с бромгидратом трифенилфосфина; последний выделяли с количественным выходом при пропускании тока нвг в раствор трифенилфосфина в дихлорметане. В обоих случаях реакцию проводили нагреванием смеси реагентов в сухом толуоле до исчезновения в реакционной смеси исходного спирта или галогенпроизводного. При сравнении этих двух вариантов более удобным в препаративном отношении является путь Б; так как он использует менее токсичные реагенты и дает сравнимые результаты с методом А (см. табл. 8). Однако, основным критерием выбора пути А или Б является доступность исходных соединений. Структура фосфониевых солей (23,48-59) подтверждена данными ИК-спектроско-нии и элементного анализа или сравнением с литературными данными. Хотя ИК-спектры для ряда соединений были идентичны приведенным в работе [I26J, и полученные фосфониевые соли имели удовлетворительные данные элементного анализа, но все же полученная информация была недостаточной для точного отнесения структуры и определения гомогенности синтезированных солей (23,48-59). Необходимо было разработать метод, который позволил бы однозначно отнести структуру и оценить чистоту этих веществ.
Для этой цели нами был предложен метод Р-ЯМР-спектроскопии. Так, было показано, что все фосфониевые соли (23,48-59) имели единственный сигнал ядра четвертичного атома фосфора в области 18-24 м.д. в более слабом поле (относительно сигнала 85% ортофосфорной кислоты в качестве внешнего стандарта), который сильно отличается от величины химических сдвигов исходных реагентов PhoP (- 4,76 м.д.) и Ph,p.HBr (- 8,47 м.д.) и возможных побочных продуктов, в том числе PhgP=0 (29,69 м.д.). Этот прием служил надежным доказательством гомогенности синтезированных фосфониевых солей (23,48-59). При сравнении химических сдвигов фосфониевых солей различного строения можно отметить некоторые особенности: а) химический сдвиг ядер Р в изученном ряду соединений слабо зависит от величины электронных эффектов заместителя в бензольном кольце; б) более сильное влияние оказывают пространственные эффекты заместителей вблизи ot-углеродного атома соли (ср. соединения (49,50) и (23,54)). 2.2.2. Синтез 11,12-дегидроретинолов и их аналогов олефи-нированием по Виттигу ГиНТЕРМЕДИАТ д]. Реакция Виттига и ряд ее модификаций относится к одному из основных способов фрагментной конденсации в химии полиеновых соединений. Несмотря на многочисленные исследования условий проведения и механизма этой реакции, её ещё нельзя считать окончательно изученной. Наиболее полная информация о природе и стереоселектив- ности олефинирования по Виттигу содержится в ряде обзоров последних лет Гзз,127-1321. Поэтому в настоящей работе мы остановимся на этом вопросе лишь кратко. Согласно данным Бестманна [зз] оле-финирование по Виттигу протекает через образование ряда промежуточных интермедиатов (схема 27). На первой стадии в результате циклоприсоединения происходит образование оксафосфетана (62), последующая перегруппировка лигандов (псевдовращение) в котором приводит к оксафосфетану (63). Оксафосфетаны стабильны при температуре ниже -30С и могут быть зафиксированы с помощью Р-ЯМР--спектроскопии [І32І. Расщепление С-Р-связи вызывает образование эритро-бетаина (64), который либо претерпевает элиминирование трифенилфосфиноксида с образованием Z-олефина (65), либо вращение вокруг одинарной С-С-связи, приводит к термодинамически более стабильному трео-бетаину (66), из которого после элиминирования трифенилфосфиноксида образуется Е-алкен (67). Соотношение образующихся I- и Е-изомерных алкенов (65,67) зависит от ряда факторов. Главнымииз которых являются: а) природа заместителей у оС--углеродного атома илида, стационарных лигандов у атома фосфора и заместителя у карбонильного соединения; б) природа используемого основания; в) растворитель; г) соотношение реагентов; д) добавки солей и кислот Льюиса; е) температура; ж) давление. Наиболее сильное влияние на стереоселективность олефинирова-ния по Виттигу оказывает характер заместителя у о(-углеродного атома илида. Строение молекулы илида можно представить как совокупность двух граничных структур: иленовой ( 69 ) и илидной (70 ), в которых заряд делокализован из-за возможного "/ сопряжения. Если R , R - электронодонорные заместители, то такие илиды имеют очень высокую реакционную способность, а если R , R - элект-роноакцепторные заместители, то нуклеофильность илидного атома и их реакционная способность снижены.
Илиды, генерированные из фосфониевых солей (23,48-54) занимают промежуточное положение между активными и стабильными илидами. Известно, что олефиниро-вание илидов такого рода проходит нестереоспецифично и приводит, как правило, к смеси, содержащей как Z-, так и Е-изомерные алке-ны [іЗі"]. Так как часто перечисленные выше факторы могут оказывать прямо противоположный эффект, то для того чтобы выявить вли- яние заместителя у о-углеродного атома илидов, генерированных из фосфониевых солей (23,48-54), на стереонаправленность процесса и выходы образующихся дегидроретинолов (15,10) и их аналогов (71-76) нами были использованы стандартные условия проведения олефинирования: реакцию проводили в тетрагидрофуране при -40 —30С, за 2 ч, используя в качестве основания раствор 1,5 экв. н-бутиллития в пентане, концентрацию которого предварительно определяли титрованием. Соотношения образующихся изомеров и суммарные выходы соединений представлены в табл. 9. Из её рассмотрения видно, что наличие объемного заместителя у об-углерод-ного атома илида, например, в случае триметилциклогексенового кольца, приводит к исключительному образованию 7Е-изомера 132-П,12-дегидроретинола (15). Однако, уже при изменении расположения одной метильной группы с одновременным"уплощением цикла у мезитиленового производного (77), наблюдается снижение стерео-специфичности реакции. Обнаружена также определенная корреляция между значениями константы Гаммета (6 ) заместителя и долей образующего 7Е-изомера: по мере уменьшения значения (э - доля п 7Е-изомера увеличивается. Все 7Е- и 7-изомеры соединений (71-77 а,б) (см. табл. 9) были выделены с помощью адсорбционной колоночной-хроматографии. Их структура подтверждена ИК-, УФ-, %- и - С-ЯМР- и масс-спектрами (см. ниже). В дальнейших превращениях использовали исключительно 7Е-изомеры полученных 11,12--дегидропроизводных (71 а .- 77 а). Полученные нами результаты и сами условия проведения превращений, несмотря на их высокую воспроизводимость, ещё были далеки от совершенства. Это побудило нас провести дополнительные эксперименты, направленные на исследование влияния природы используемого основания и растворителя на выходы и стереоселективность олефинирования на примере взаимо- Выходы и соотношение 7Е/ 72-изомеров, образую- Таблица 9 щихся при олефинировании по Виттигу фосфониевых солей (23,48-54)
Синтез ароматических аналогов 13г-ретиналя
Получение полиеналей I3Z-pHfla, содержащих вместо тримегилцик-логексенового замещенное ароматическое кольцо осуществляли по схеме 29. Подход, использованный нами ранее при синтезе I3Z-pe-тиналя (I), оказался неэффективным при синтезе его аналогов. По-видимому, из-за изменения характера сорбции веществ, содержащих ароматическое кольцо, на катализаторе Линдлара, нам не удалось провести направленное превращение 11,12-дегидропроизводных (71 а - 77 а) в соответствующие аналоги ретинола. Несмотря на широкое варьирование условий (соотношение катализатор/субстрат, до- полнительное травление солями РЪ , Cd и хинолином), в результате гидрирования получали сложную смесь продуктов. Аналогичное явление было отмечено Лиу с сотр. [78J, которые не смогли осуществить переход от ароматических аналогов 11,12-дегидроретинолов к соответствующим полиеналям и вынуждены были отказаться от реализации подобной схемы. Однако, нами успех был достигнут простым изменением порядка проведения превращений: сначала следовало окисление дегидроспиртов (71 а - 77 а) до соответствующих альдегидов (80-86), а затем - гидрирование и термоизомеризация [142]. Следует отметить, что IIZ —-ПЕ-термоизомеризация протекала в ряде случаев не столь направленно, как при синтезе ізг-ретиналя (I) и для соединений (94,97-99) наблюдалось также частичное I3Z—» 13Е--превращение. Но для получения искусственных пигментов это не имеет принципиального значения, так как БО в одинаковой степени связывает изомеры как аП-Е-, так и ізг-рядов. I3Z- и аП-Е-изомеры альдегидов (94-105) были разделены препаративной ВЭ1Х. Целевые альдегиды (94-105) были получены в индивидуальном, в некоторых случаях кристаллическом состоянии; их гомогенность установлена методом ВЭЖХ, а структура - данными %-ЯМР- и масс-спектров (см. табл. II и б п.). В спектрах Н-ЯМР 13г-изомеров полие-налей (94-100) четко прослеживались сдвиги сигналов І2-Н на 0,9--I м.д. и І5-Н на 0,1 м.д. в область слабого поля, СН?-группы при CJ(I3) "aT0Me на 0,16-0,2 м.д. в область сильного поля по сравнению со спектрами аП-Е-изомеров (I0I-I05). Подобное явление было описано в работе [144] и для 13г-ретиналя (I), что являлось строгим доказательством сохранения I3Z-KOH$nrypa4HH соединений в процессе всего синтеза.
Все синтезированные соединения тестированы далее в реакции с бактериоопсином, входящим в состав апомембран, которые получали в свою очередь обесцвечиванием пурпурных мембран из На-lobacterium halobium. Г 150J. При этом было установлено, что все полиенали образуют с БО ис- к Консультация и помощь в выполнении этой части работы были оказаны ст. научн. сотр. А.М.Шкробом (ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР). кусственные пигменты, в которых эти альдегиды связываются в виде протонированных альдиминов с -аминогруппами остатков лизина. Для определения величины "белкового сдвига" как разницы в поло- —т жении абсорбционных, максимумов (см ) протонированных форм альдиминов ретиналя и темноадаптированных хромопротеидов нами синтезированы: из соединении (94 - 100) альдимины на основе н-бутил-амина и определены значения их максимумов поглощения в форме оснований и соответствующих сопряженных кислот как в протонном растворителе (метанол), так и в апротонном поляризующемся растворителе (СС14) ( табл. 12 ). Интерпретация полученных данных хорошо согласуется с моделью внешнего точечного заряда,., разработанной для БР ( см. с.26 лит. обзора ).. Действительно, замена в хромофорной группе триметилциклогексенового кольца на ароматическое приводит к существенному уменьшению значения величины "белкового сдвига". Это наблюдение контрастирует с данными, известными для аналогичных экспериментов, проведенных для родопсина [53] ( см. рис. 6 . Проведенное сравнение спектральных свойств синтезированных альдегидов и их альдиминов со свойствами соответствующих хромопротеидов, полученных на основе их взаимодействия с БО, позволяет сделать следующие выводы: а); наблюдается рост значения величины "белкового сдвига" в следующем ряду аналогов ЕР: С1 Р Е СЕ3 0СНз б) введение объемного заместителя (трет-бутильной группы) вызывает дополнительные стерические возмущения в белковом окружении таким образом, что уменьшается влияние "внешнего точечного заряда" - для этого производного обнаружено минимальное значение "белкового сдвига"; в) замена незамещенного бензольного кольца на мезитиленовое (100) приводит к увеличению значения "белкового сдвига"; однако, только для последнего пигмента отмечен гипсохромный сдвиг при переходе от темноадаптированной формы пигмента к светоадаптиро-ванной на 8 ни. Все спектральные исследования проводили при 20С. ИК-спектры снимали на приборах " Perkin Erliaer -257 " (Англия) или. " Shimadzu IR-435 " (Япония) в пленке (для жидкостей) или в виде пасты с вазелиновым маслом (для кристаллических соединений). УФ-спектры получали на спектрофотометрах " Hitachi EPS-3T " или " Shimadzu UV-240 " (Япония) в метаноле в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм. Спектры -%-ЯМР регистрировали в дейтерохлорофор-ме на спектрометрах " Bruker WH-90 " или " WM-250 " (ФРГ) с рабочими частотами 90 или 250 МГц, соответственно. Химические сдвиги приведены в миллионных долях относительно внутреннего стандарта тетраметилсилана ( 0Г000) или гексаметилдисилоксана (8 0,055). то Величины КССВ измерены в Гц. Спектры С-ЯМР записаны в дейтеро-хлороформе на приборе " Bruker WM-250 ", внутренний стандарт дей-терохлороформ ({Г 77,70 ).
Для съемки спектров использовались: широкополосная развязка от протонов, а также импульсные последовательности {/-модулированного спин-эха и "gated decoupling ". Спектры %-ЯМР регистрировали в хлороформе на приборе "Bruker WM-250 ", внешний стандарт - 85% раствор ортофосфорной кислоты. При описании спектров приняты следующие сокращения: с. -сильная, ср. - средняя, ел. - слабая, ш - широкая, с - синглет, д - дублет, т - триплет, кв - квартет, м - мультиплет. Масс-спектры получены на приборах " Varian МАТ СН-6 " или " Finnigan 4021 » (США). Хроматографию в тонком слое осуществляли на пластинках Kiselgel 60 Р254 и Silica Gel 60 F254 ( Merck , ФРГ) в системах растворителей: гексан - эфир, 2:1 (А); 1:1 (Б); 1:2 (В) или хлороформе (Г). Пятна веществ обнаруживали опрыскиванием прояв- ленных хроматограмм серной кислотой или 3% спиртовым раствором ванилина, а также в УФ-свете. Сканирование пятен осуществляли на денситометре a?LC scanner ( Camag , Швейцария). Препаративную хроматографию проводили на силикагелях Л 40/100 или 100/250 меш ( Chemapol , ЧССР) и окиси алюминия ІУ степени активности по Брок-ману ( Reanal , ВНР). Препаративную ВЭЖХ проводили на стеклянной колонке ( 350 X 7 мм ) с фазой Silasorb 600, 20 мкм ( Chemapol , ЧССР), а аналитическую на колонке ( 250x4,6 мм ) с фазой Zorbax-SIL ( Du Pont , США), элюент: гексан - эфир, скорость I мл/мин, одновременное детектирование при длине волны, соответствующей абсорбционному максимуму вещества, и 254 ни. В работе использовались реактивы и препараты отечественного производства марки "х.ч." и "ч.д.а.", а также пентафторбензилбромид ( Serva , ФРГ ), 2,4,6-триметилбензилбромид, 4-хлор-, 4-фтор-, 4-трет-бутилбен-зиловые спирты ( piuka , Швейцария ), трифенилфосфин ( chemapol , ЧССР ). Индивидуальные по данным ГЖХ ( хроматограф мХром-4" (ЧССР), колонка 2,5 м, фаза 10% полиэтиленгликольадипат на хроматоне H-AW температура испарителя 200С, температура колонки 120С, газ носитель - азот , скорость 30 мл/мин )-21- (7Ґ- 6,3 мин ) и Е-(t- 10,7 мин ) -изомеры 3-метилпент-2-ен-4-ин-1-ола (6,5) получали ректификацией технических продуктов. Все операции с реагентами, чувствительными к влаге и кислороду воздуха проводили в атмосфере сухого аргона в тщательно высушенной аппаратуре. Растворы упаривали в вакууме при температуре не выше 30 - 40С. Работа с полиеновыми соединениями проводилась в затемненном помещении.