Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств Деженков Андрей Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

Литературный обзор 8

Метилфосфонаты 10

Общая характеристика 10

Синтез метилфосфонатов 10

Свойства и применение метилфосфонатов 12

Фосфотиоаты 16

Общая характеристика 16

Синтез фосфотиоатов 17

Свойства и применение фосфотиоатов 21

«Замкнутые» нуклеиновые кислоты 23

Общая характеристика 23

Синтез «замкнутых» нуклеиновых кислот 25

Свойства и применение «закрытые» нуклеиновых кислот 27

Миметики на основе морфолина 28

Общая характеристика 28

Синтез миметиков на основе морфолина 29

Свойства и применение миметиков на основе морфолина 31

Полиамидные миметики нуклеиновых кислот 33

Общая характеристика 33

Синтез полиамидных миметиков нуклеиновых кислот 35

Свойства и применение полиамидных миметиков нуклеиновых кислот 37

Заключение 42

Теоретическая часть 44

Синтез пуринсодержащих мономеров ПНК. 45

Синтез защищенных гетероциклических оснований 45

Синтез мономеров ОЗ ПНК 50

Подтверждение региоселективности реакции алкилирования пуринсодержащих гетероциклов. 54

Определения оптической чистоты тиминсодержащих мономеров 57

Определение конформаций хиральных ПНК. 61

Исследование биологической активности полученых гуанинсодержащих производных.

CLASS Экспериментальная часть CLASS 70

Синтез защищенных гетероциклических оснований 71

Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот 72

Синтез тиминсодержащих энантиомеров 79

Синтез димера на основе дейтерированного глицина. 82

Биологические испытания 86

Выводы. 87

Список литературы 88

• Синтез метилфосфонатов
• «Замкнутые» нуклеиновые кислоты
• Синтез защищенных гетероциклических оснований
• Синтез тиминсодержащих энантиомеров

Синтез метилфосфонатов

Время конденсации мономеров аналогично синтезу олигонуклеотидов ОН (ОДН) фосфоамидитным способом. Так как метилфосфонатные связи подвержены гидролизу при длительной обработке с неорганическими основаниями, то для удаления защитных групп и отщепления олигомера со смолы используют этилендиамин. Вначале проводят 30 мин обработку смолы раствором гидроксида аммония при комнатной температуре. После чего добавляют равный объем этилендиамина и продолжают обработку в течение 6 часов. Реакцию останавливают разбавлением водой и нейтрализацией либо HCl, либо уксусной кислотой. Олигомеры выделяют при помощи ОФ ВЭЖХ, либо ионообменной хроматографии при наличии 5 -фосфордиэфирной межнуклеотидной связи [17].

Свойства и применение метилфосфонатов Метилфосфонаты стабильны в водных растворах с рН 7 при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 1 недели (в зависимости от состава олигомера и его длины период хранения может достигать более длительного времени). Замороженные растворы олигомеров могут хранится в течение 6 месяцев без значительной деградации. Особенно стабильны олигомеры при хранении в виде лиофилизованных порошков или в растворах этанола с водой или ацетонитрила с водой. В этом случае, срок хранения олигомеров достигает 1 года при -20оС. Метилфосфонаты также стабильны при мягких кислотных условиях водного раствора. Однако обработка с 1н HCl приводит к депуринизации и последующему расщеплению цепей метифосфонатов. Скорость депуринизации, как оказалось, происходит медленнее, чем у олигодезоксирибонуклеотидов при тех же условиях. Метилфосфонаты, состоящие из 2 -0-метилрибонуклеозидов, крайне устойчивы в кислых условиях. Так, инкубация 12-мера, содержащего как 2 -0-метилгуанинрибонуклеозид, так и 2 -0-метиладенинрибонуклеозид с 1н HCl в течение 12 ч при 37оС не приводили к гидролизу и депуринизации этих олигомеров [17].

Гидролиз обоих видов метилфосфонатов осуществляется в водных растворах при основных рН. Некоторые вторичные амины, такие как пиперидин и морфолин, особенно эффективно гидролизуют метилфосфонатные связи. Гидролиз приводит к образованию олигомеров и мономеров, которые терминированы либо гидроксильной группой, либо группой метилфосфоновой кислоты. Метилфосфонатные связи устойчивы к гидролизу экзонуклеазами, такими как фосфодиэстераза змеиного яда и фосфодиэстераза селезенки, и эндонуклеазами, такими как микрококковая нуклеаза и ДНКаза I. Растворимость метилфосфонатов зависит от длины олигомерной цепи и количества G и C нуклеотидов. Олигонуклеотиды длиной от 12 до 16 нуклеотидов могут быть растворены в водных буферах, давая растворы с максимальной концентрацией олигомеров в диапазоне от 500М до 1 mM. Олигомеры, которые содержат большое количество G остатков имеют более низкую растворимость [17].

Метилфосфонаты образуют стабильные дуплексы с комплементарными последовательностями ОН (ОДН). Стабильность дуплексов увеличивается с увеличением длины последовательности метилфосфонатов. В отличие от ДНК, в случае метилфосфонатов, на связывание с ОН (ОДН) не оказывает влияние ионная сила раствора. Это свойство обусловоено отсутствием электростатического отталкивания между незаряженным метилфосфонатным остовом и отрицательно-заряженным фосфодиэфирным скелетом ОН (ОДН). Дуплексы, образованные между метифосфонатами и ОДН подобны аналогичным структурам, образованным олигодезоксирибонуклеотидами. Политиминовые метилфосфонаты особенно чувствительны к конфигурации метилфосфонатной связи. Miller et al. [18] показали, что декамеры, содержащие стереорегулярный остов, состоящий либо из (R)-, либо из (S)-мономеров, образовывали комплексы с комплементарными ДНК и РНК различной стабильности. Оказалось, что (R)-метилфосфонаты более стабильны, температура плавления дуплексов, образованных (S)-изомерами была ниже на 2-4оС. Дуплексы, образованные олигомерами содержащими пуриновые основания менее чувствительны к конфигурации остова. Также гомопуриновые метилфосфнаты способны образовывать триплексы с дцДНК содержащими, либо гомопиримидиновую, либо гомопуриновую последовательность оцДНК, причем стабильность таких триплексов выше, чем у ДНК. Метилфосфонаты не показывают РНКазной активности. Фосфоруглеродные связи в метилфосфонатах обеспечивают более высокое сродство при взаимодействии с РНК, что благоприятно для антисмысловой терапии [17].

Метилфосфонаты из 2 -О-метилрибонуклеозидов показывают значительно более высокую аффинность связывания с РНК, так комплекс 12-мера с РНК имел температуру плавления выше на 15оС, чем в случае дезоксиметилфосфонат/РНК дуплекса [17]. Miller et al. использовали метилфосфонаты из 2 -О-метилрибонуклеозидов против РНК вируса иммунодефицита человека, которая отвечает за начало репликации вируса и представляет собой петлеобразную структуру [19]. В ходе эксперимента были получены 7 олигомеров (13-19), принимающих структуру подобную ТАР РНК (табл. 1).

Олигомеры, за исключением 16, имели в своем составе смесь диастереомеров, тогда как олигомер 16, содержащий в своем составе только две метилфосфонатные связи, тем самым образовывал четыре диастереомера (RR, SS, RS, SR), которые были разделены при помощи ОФ ВЭЖХ.

«Замкнутые» нуклеиновые кислоты

Синтез МО является довольно простым и малозатратным, не требуя для образования фосфодиамидных связей дорогостоящих катализаторов и реагентов. Морфолино мономеры получают из природных рибонуклеозидов (рА, рС, рG), в качестве исходного вещества для четвертого мономера используется синтетический рибонуклеотид рТ вместо натурального рU, в качестве защитных групп экзоциклических аминогрупп нуклеиновых оснований для цитозина и аденина используют бензоильную защитную группу, а для гуанина - фенилацетильную защитную группу (схема 8). Ключевыми этапами синтеза морфолино мономеров являются следующие стадии: окислительное раскрытие 5-членного кольца рибозы 61 с образованием диальдегида 62; восстановительное аминирование получившегося диальдегида 62 с аммиаком, что приводит к образованию 6-членного кольца морфолина 63 с последующим восстановлением 2 и 3 -гидрокси групп, что делает возможным получить мономер 64. Все эти реакции выполняются последовательно в одном реакционном сосуде без промежуточной очистки интермедиатов. Введение тритильной защиты на вторичную аминогруппу морфолина, за которым следует присоединение хлорфосфоамидатной функции к 5 -гидроксильной группе приводит к образованию фосфоамидатному синтону на основе морфолина 65. Конечные фсофоамидатные мономеры имеют длительный период хранения в течение нескольких месяцев при температуре -20С [55].

Получение морфолино олигомеров состоит из конденсации субъединиц циклических аналогов и удаления защиты с N-конца действием раствора цианоуксуной кислоты в смеси CH3CN/DCM (схема 9) [55]. Стадия кэппирования не используется, потому что эффективность конденсации и удаления защиты являются крайне высокими (около 99.7 % для каждой стадии). Около 80 % растворителей, используемых в стадиях промывки, могут быть собраны, перегнаны и заново использованы. Эта рекуперация позволяет сэкономить значительные материальные потери при синтезе. Также ввиду высокой стабильности активированных морфолино субъединиц, их избытки, используемые для проведения стадии конденсации до полного превращения, могут быть собраны и использованы заново. Такая экономия имеет крайне важное значение при разработке технологии производства МО в качестве терапевтических препаратов. Схема 9. Твердофазный синтез МО [55].

Морфолино остов стабилен при действии сильных оснований, но в среднекислых средах он расщепляется, например, при действии трифторуксусной кислоты. Чувствительность МО к действию кислот вводит некоторые ограничения на возможные химические процессы, но в тоже время такая чувствительность имеет одно значительное преимущество это быстрое и легкое подтверждение последовательности олигомеров. В этом методе небольшая порция смолы с прикрепленным к ней олигомером обрабатывается трифторуксусной кислотой (в течение 40 минут при комнатной температуре), чтобы произвести одно удаление на олигомерной цепи. Смола промывается для удаления TFA и 3 -концевого фрагмента, после чего добавляют гидроксид аммония для того, чтобы отщепить оставшийся олигомер от смолы и удалить защитные группы с нуклеиновых оснований. Масс-спектроскопия позволяет оценить последовательность при помощи вычисления дифференциалов масс между соответствующими фрагментами пиков [55].

Свойства и применение миметиков на основе морфолина Незаряженные фосфоамидатные морфолино-олигомеры хорошо растворимы в воде. Морфолино-олигомеры устойчивы к действию нуклеаз и другим факторам деградации в биологических системах. Поэтому, они эффективны в экспериментах длительного времени, и мало подвержены побочным реакциям, что обеспечивает низкую токсичность. Флуоресцеинмеченные морфолино-олигомеры, помещенные в клетки распределяются по всему цитозолю и клеточному ядру, тем самым, имея доступ к РНК-мишеням, как во время короткого пребывания РНК в ядре, так и их длительного нахождения в цитозоле [45].

МО принадлежат к РНКаза Н-независимым олигомерам, в целом, они эффективны против большинства последовательностей 15-20 оснований (МИД морфолино олигомеров – 15 п. о. [54]) от 5 -кэп участка до AUG трансляционного сайта любой выбранной мРНК. Такой небольшой сайт связывания некритичен в случае РНКаза Н-независимых олигомеров, подобных МО, так как требуется, чтобы их целевые последовательности были отличны от около 2-5% последовательностей, содержащихся в цитоплазме (остальные 95-98% - это интроны и последовательности не более 25 оснований от 3 конца до участка начала трансляции). Таким образом, МО могут эффективно достигать наилучшей специфичности, что является немаловажным свойством антисмысловых олигонуклеотидов [45].

Аффинность связывания с комплементарными последовательностями ОН (ОДН) относительно нечувствительна к ионной силе среды. В случае ДНК/ДНК и ДНК/РНК комплексов температура плавления значительно уменьшается с уменьшением концентрации хлорида натрия в водном растворе. В случае же комплексов ДНК (РНК) с МО температура устойчивости комплекса остается почти неизменной. Такая независимость от ионной силы среды дает преимущество перед анионными ДНК и РНК в применении в качестве диагностикумов в физиологической среде [55]. МО/РНК дуплекс более стабилен, чем соответствующий ДНК/РНК дуплекс, а также более стабилен, чем соответствующий фосфотиоат/РНК дуплекс [13, 55] (табл. 5). Таблица 5. Сравнение устойчивости комплексов миметиков нуклеиновых кислот с РНК [13, 55].

Синтез защищенных гетероциклических оснований

Поскольку ключевое влияние на взаимодействие ПНК с комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот имеет конфигурация хирального центра (R или S) и его местоположение в псевдопептидном скелете, исключительно важна оптическая чистота (не менее 95%) мономеров хиральных ПНК.

N H о Так как первыми хиральными мономерами ПНК были -производные, то разработка методов определения энантиомерной чистоты ПНК началась с них. Dueholm K. L. et al. [108] опробовали метод, основанный на получении диастереомеров 33 и 34, при синтезе -мономеров ПНК на основе аланина, конденсацией конечных мономеров 31 и 32 (из L-, D-аланина, соответственно) с трет-бутиловым эфиром L-аланина (Схема 10). Разделение при помощи ВЭЖХ показало, что оптическая чистота диастереомера из мономера ПНК на основе L-аланина 94%.

Позже Nielsen P. E. et al. [81] использовали аналогичный подход для определения ЭЧ мономеров на основе L-Ser, D-GIu, L-Lys. С этой цель были получены диастереомеры реакцией целевых мономеров с L-Ile (35а-с) и (L,D)-Ile (36а-с) (Рис. 6). Разделение смеси диастереомеров, на основе рацемического изолейцина, и хроматография остальных диастереомеров в подобранных условиях показала, что оптическая чистота диастереомеров составляет 90%.

При синтезе -мономеров ГПНК Ly D. H. et al. [4] использовали косвенный метод, основанный на 19F-ЯМР-спектроскопии. С этой целью были приготовлены диастереомеры 38а при помощи конденсации мономеров с реагентом Мошера (-метокси--(трифторметил)фенилацетил хлорид) (Схема 11). Анализ ЯМР-спектров на ядрах F-19 показал, что энантиомерная чистота диастереомеров 99%. Аналогичная стратегия была применена в случае получения мономеров миниполиэтиленгликоль (ПЭГ) ПНК 37b и результаты по оценке энантиомерной чистоты оказались схожими с результатами по ГПНК [109].

Корейская группа под руководством Lee W. использовали прямой метод для определения оптической чистоты мономеров ПНК. Так для разделения энантиомерных форм Fmoc-мономеров -ПНК на основе L-глутаминовой кислоты 39а,Ь (Рис. 7) была использована стационарная фаза Chiralpak IB, иммобилизованная полисахаридами. Разделение рацемической смеси при помощи ВЭЖХ и последующее хроматография тиминового мономера на основе L-глутаминовой кислоты, показали, что энантиомерная чистота мономера составляет 99.9% [ПО]. Аналогичные результаты были получены в случае -мономеров ПНК 40а,Ь на основе L-Lys (Рис. 7) [111].

В нашей работе был реализован прямой метод определения энантиомерного избытка на примере тиминовых -мономеров 45а, 46а и -мономеров 45b, 46Ь (рис. 8), которые были синтезированы, по раннее описанной стратегии (схема 12). Использование прямого метода было обусловлено тем, что в случае проведения предварительной дериватизации мономеров 45а, 46а по С-концу возможна частичная рацемизация, что наблюдалось при проведении анализа диастереомеров на основе L- и D-A\a [7]. [Pd(PPh3)4] N-этиланилин

Для разделения смеси (К)- и (5)-энантиомеров была использована хроматографическая колонка, загруженная новым гибридным сорбентом на основе силикагеля с иммобилизованным антибиотиком - эремомицином. Ранее было показано, что данный хиральный сорбент обладает высокой энантиоселективностью по отношению к модифицированным а- и -аминокислотам и их производным [112]. Результаты разделения представлены на рисунке 9. , -R

Рисунок 9. Хроматограммы разделения рацемической смеси тиминсодержащих мономеров 45Ъ, 46Ъ (А)а и (8)-тиминсодержащего мономера 45Ъ (из L-Glu) (Б)а; рацемической смеси тиминсодержащих мономеров 45а, 46а (В)б и (S) тиминсодержащего мономера 45а (из L-Glu)б (Г). аколонка Diasphere-110-Chirasel-E-PA, элюент: МеОН/СНзСООН = 94/6 (v/v), скорость потока 1 мл/мин, UV 254 нм, температура 20С; бколонка Diasphere-Chirasel-E, элюент: МеОН/СНзСООН/ТЕА=100/0.1/0.1 (v/v/v), скорость потока 0.5 мл/мин, UV 254 нм, температура 20С

Расчёт площади хроматографических пиков показал, что оптическая чистота мономера 45Ь составляет 99,1%, а а-мономера 45а - 95%, что представлялось достаточным для проведения дальнейшей олигомеризации на твердой фазе.

Таким образом, было показано, что описанная стратегия синтеза мономеров обеспечивает необходимую оптическую чистоту конечных мономеров, что является одним из немаловажных условий для дальнейшей олигомеризации на полимерном носителе. Также использованный в работе сорбент может быть применен для определения оптической чистоты других хиральных мономеров ПНК.

Определение конформаций хиральных ПНК. Изучение пространственной конфигурации молекул ПНК является крайне важной задачей. При использовании КД-спектроскопии было показано, что ахиральные ПНК имеют неупорядоченную структуру и принимают спиральную форму только при образовании комплекса с НК, введение же заместителя в структуру ПНК способствует преорганизации молекулы ПНК, причем важно положение заместителя в структуре ПНК: в случае ( -конфигурации в у-положения образуется правозакрученная преорганизация, в случае а-положения левозакрученная. При изменении конфигурации стереогенного центра в мономере ПНК происходит обращение конформации олигомера ПНК с правозакрученной на левозакрученную (для -ПНК), и наоборот (для -ПНК). Позже было показано, что для доказательства пространственной преорганизации молекул ПНК можно использовать методы ЯМР-спектроскопии. Для этой цели использовался модельный димер, имеющий в своей структуре хиральный мономер у-ПНК, изучение методами двумерной ЯМР-спектроскопии подтверждало наличие правозакрученной преорганизации [79, ИЗ], но в тоже время наложение сигналов аминоэтильных протонов псевдопептидных остовов препятствовало четкому определению констант спин-спинового взаимодействия в одномерных спектрах, которые в данном случае являются ключевым фактором для проведения исследования. Мы посчитали рациональным синтез димера, состоящего из хирального мономера на основе L-Ala и aegПНК мономера, причем метиленовые протоны в aeg-мономере замещены на атомы дейтерия, что должно было способствовать существенному упрощению !Н-ЯМР спектра димера и легкости интерпретации двумерного COSY-спектра и одномерного Н-спектра.

С этой целью нами был проведен синтез мономера «классических» ПНК на основе дейтерированного глицина (схема 13). Гидрохлорид метилового эфира дейтерированного глицина 48 был получен из Бг-глицина 47 действием тионилхлорида в метаноле, взаимодействие 48 с (дареда-бутилокси)пирокарбонатом в присутствии NaHC03 приводило к образованию 5ос-защищенного метилового эфира глицина 49. Реакцией последнего с 2-нитробензолсульфонил хлоридом в присутствии триэтиламина получали Ns-производное метилового эфира дейтерированного глицина 50. Дейтерированный 5ос-этаноламин 51 получали восстановлением 49 действием LiAlD4 в ТГФ. Реакция Мицунобу между спиртвой компонентой 51 и Ns-производным дейтерированного глицина 50 («кислотная» компонента) приводила к образованию полностью защищенного псевдопептида 52. Тиолизом псевдопептида 52 получали вторичный амин 53. Ацилирование амина 53 бромацетилбромидом в присутствии триэтиамина давало бромацетамидное произовдное 54. Последующее алкилирование тимина бромацетамидным производным 54 приводило к образованию полностью защищенного тиминсодержащего мономера 55. Удаление метильной защиты действием 2М NaOH давало Вос-защищенный тиминовый дейтерированный aeg-мономер 56.

Синтез тиминсодержащих энантиомеров

Позже Nielsen P. E. et al. [81] использовали аналогичный подход для определения ЭЧ мономеров на основе L-Ser, D-GIu, L-Lys. С этой цель были получены диастереомеры реакцией целевых мономеров с L-Ile (35а-с) и (L,D)-Ile (36а-с) (Рис. 6). Разделение смеси диастереомеров, на основе рацемического изолейцина, и хроматография остальных диастереомеров в подобранных условиях показала, что оптическая чистота диастереомеров составляет 90%.

При синтезе -мономеров ГПНК Ly D. H. et al. [4] использовали косвенный метод, основанный на 19F-ЯМР-спектроскопии. С этой целью были приготовлены диастереомеры 38а при помощи конденсации мономеров с реагентом Мошера (-метокси--(трифторметил)фенилацетил хлорид) (Схема 11). Анализ ЯМР-спектров на ядрах F-19 показал, что энантиомерная чистота диастереомеров 99%. Аналогичная стратегия была применена в случае получения мономеров миниполиэтиленгликоль (ПЭГ) ПНК 37b и результаты по оценке энантиомерной чистоты оказались схожими с результатами по ГПНК [109].

Корейская группа под руководством Lee W. использовали прямой метод для определения оптической чистоты мономеров ПНК. Так для разделения энантиомерных форм Fmoc-мономеров -ПНК на основе L-глутаминовой кислоты 39а,Ь (Рис. 7) была использована стационарная фаза Chiralpak IB, иммобилизованная полисахаридами. Разделение рацемической смеси при помощи ВЭЖХ и последующее хроматография тиминового мономера на основе L-глутаминовой кислоты, показали, что энантиомерная чистота мономера составляет 99.9% [ПО]. Аналогичные результаты были получены в случае -мономеров ПНК 40а,Ь на основе L-Lys (Рис. 7) [111].

В нашей работе был реализован прямой метод определения энантиомерного избытка на примере тиминовых -мономеров 45а, 46а и -мономеров 45b, 46Ь (рис. 8), которые были синтезированы, по раннее описанной стратегии (схема 12). Использование прямого метода было обусловлено тем, что в случае проведения предварительной дериватизации мономеров 45а, 46а по С-концу возможна частичная рацемизация, что наблюдалось при проведении анализа диастереомеров на основе L- и D-A\a [7]. [Pd(PPh3)4] N-этиланилин

Для разделения смеси (К)- и (5)-энантиомеров была использована хроматографическая колонка, загруженная новым гибридным сорбентом на основе силикагеля с иммобилизованным антибиотиком - эремомицином. Ранее было показано, что данный хиральный сорбент обладает высокой энантиоселективностью по отношению к модифицированным а- и -аминокислотам и их производным [112]. Результаты разделения представлены на рисунке 9. , -R Рисунок 9. Хроматограммы разделения рацемической смеси тиминсодержащих мономеров 45Ъ, 46Ъ (А)а и (8)-тиминсодержащего мономера 45Ъ (из L-Glu) (Б)а; рацемической смеси тиминсодержащих мономеров 45а, 46а (В)б и (S) тиминсодержащего мономера 45а (из L-Glu)б (Г). аколонка Diasphere-110-Chirasel-E-PA, элюент: МеОН/СНзСООН = 94/6 (v/v), скорость потока 1 мл/мин, UV 254 нм, температура 20С; бколонка Diasphere-Chirasel-E, элюент: МеОН/СНзСООН/ТЕА=100/0.1/0.1 (v/v/v), скорость потока 0.5 мл/мин, UV 254 нм, температура 20С

Расчёт площади хроматографических пиков показал, что оптическая чистота мономера 45Ь составляет 99,1%, а а-мономера 45а - 95%, что представлялось достаточным для проведения дальнейшей олигомеризации на твердой фазе.

Таким образом, было показано, что описанная стратегия синтеза мономеров обеспечивает необходимую оптическую чистоту конечных мономеров, что является одним из немаловажных условий для дальнейшей олигомеризации на полимерном носителе. Также использованный в работе сорбент может быть применен для определения оптической чистоты других хиральных мономеров ПНК.

Определение конформаций хиральных ПНК. Изучение пространственной конфигурации молекул ПНК является крайне важной задачей. При использовании КД-спектроскопии было показано, что ахиральные ПНК имеют неупорядоченную структуру и принимают спиральную форму только при образовании комплекса с НК, введение же заместителя в структуру ПНК способствует преорганизации молекулы ПНК, причем важно положение заместителя в структуре ПНК: в случае ( -конфигурации в у-положения образуется правозакрученная преорганизация, в случае а-положения левозакрученная. При изменении конфигурации стереогенного центра в мономере ПНК происходит обращение конформации олигомера ПНК с правозакрученной на левозакрученную (для -ПНК), и наоборот (для -ПНК). Позже было показано, что для доказательства пространственной преорганизации молекул ПНК можно использовать методы ЯМР-спектроскопии. Для этой цели использовался модельный димер, имеющий в своей структуре хиральный мономер у-ПНК, изучение методами двумерной ЯМР-спектроскопии подтверждало наличие правозакрученной преорганизации [79, ИЗ], но в тоже время наложение сигналов аминоэтильных протонов псевдопептидных остовов препятствовало четкому определению констант спин-спинового взаимодействия в одномерных спектрах, которые в данном случае являются ключевым фактором для проведения исследования. Мы посчитали рациональным синтез димера, состоящего из хирального мономера на основе L-Ala и aegПНК мономера, причем метиленовые протоны в aeg-мономере замещены на атомы дейтерия, что должно было способствовать существенному упрощению !Н-ЯМР спектра димера и легкости интерпретации двумерного COSY-спектра и одномерного Н-спектра.

С этой целью нами был проведен синтез мономера «классических» ПНК на основе дейтерированного глицина (схема 13). Гидрохлорид метилового эфира дейтерированного глицина 48 был получен из Бг-глицина 47 действием тионилхлорида в метаноле, взаимодействие 48 с (дареда-бутилокси)пирокарбонатом в присутствии NaHC03 приводило к образованию 5ос-защищенного метилового эфира глицина 49. Реакцией последнего с 2-нитробензолсульфонил хлоридом в присутствии триэтиламина получали Ns-производное метилового эфира дейтерированного глицина 50. Дейтерированный 5ос-этаноламин 51 получали восстановлением 49 действием LiAlD4 в ТГФ. Реакция Мицунобу между спиртвой компонентой 51 и Ns-производным дейтерированного глицина 50 («кислотная» компонента) приводила к образованию полностью защищенного псевдопептида 52. Тиолизом псевдопептида 52 получали вторичный амин 53. Ацилирование амина 53 бромацетилбромидом в присутствии триэтиамина давало бромацетамидное произовдное 54. Последующее алкилирование тимина бромацетамидным производным 54 приводило к образованию полностью защищенного тиминсодержащего мономера 55. Удаление метильной защиты действием 2М NaOH давало Вос-защищенный тиминовый дейтерированный aeg-мономер 56.