Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1 Гормон роста и его секретагоги 11
1.1.1 Физиологическое значение гормона роста 12
1.1.2 Заболевания, связанные с нарушением секреции гормона роста 13
1.1.3 Грелин и его рецептор 14
1.1.4 Рилизинг-пептиды гормона роста 15
1.2 Особенности метаболизма химически-модифицированных и синтетических белков и пептидов 19
1.2.1 Замена аминокислот (использование D-, - и ненатуральных аминокислот) 20
1.2.2 Замена пептидной связи (псевдопептиды) 29
1.2.3 Изменение N- и C-концевых частей молекулы 36
1.3 Методы изучения метаболизма соединений пептидной природы 40
1.3.1 Биологические модели изучения метаболизма 40
1.3.2 Аналитические подходы идентификации метаболитов 42
1.4 Методы определения GHRP и их метаболитов в допинг-контроле 45
1.4.1 Хроматомасс-спектрометрические методы 45
1.4.2 Метод конкурирующего связывания лигандов с рецептором грелина 54
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1 Химические реактивы и материалы 56
2.2 Основное оборудование 57
2.3 Вспомогательное оборудование 58
2.4 Методика эксперимента 58
2.4.1 наноВЭЖХ-МСВР анализ GHRP и их метаболитов 58
2.4.2 СВЭЖХ-МС/МС анализ GHRP и их метаболитов 60
2.4.3 Синтез метаболитов GHRP в условиях in vitro 60
2.4.4 Пробоподготовка проб мочи методом ТФЭ 63
2.4.5 Пробоподготовка проб сыворотки крови 65
2.4.6 Изучение метаболитов GHRP в образцах мочи и сыворотки крови после приема препаратов здоровыми добровольцами 66
Глава 3. Результаты и обсуждения 69
3.1 Сравнение различных in vitro и in vivo моделей метаболизма синтетических допинговых соединений пептидной природы 69
3.1.1 Протеолитические ферменты 69
3.1.2 Сыворотка человеческой крови 78
3.1.3 Субклеточные фракции 84
3.1.4 Выбор оптимальной in vitro модели моделирования процессов биотрансформации пептидных соединений в организме человека 94
3.1.5 Идентификация in vivo метаболитов GHRP в моче человека после назального приема пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина и ипаморелина 95
3.2 Разработка и валидация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС 101
3.2.1 Выбор сорбента для ТФЭ 101
3.2.2 Выбор способа доведения рН 105
3.2.3 Валидация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС 107
3.3 Апробация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС 112
3.3.1 Количественная оценка наиболее интенсивных и долгоживущих метаболитов GHRP в образцах мочи 112
3.3.2 Оценка влияния особенностей метаболизма на биотрансформацию соединений после назального и внутривенного введения GHRP-2 и назального приема GHRP-6 115
Заключение 125
Выводы 128
Благодарности 130
Список условных обозначений и сокращений 131
Список литературы 135
- Заболевания, связанные с нарушением секреции гормона роста
- Аналитические подходы идентификации метаболитов
- Синтез метаболитов GHRP в условиях in vitro
- Оценка влияния особенностей метаболизма на биотрансформацию соединений после назального и внутривенного введения GHRP-2 и назального приема GHRP-6
Введение к работе
Гормон роста (ГР) является одним из «скандально» известных допинговых препаратов. Увеличение концентрации ГР способствует росту мышечной и костной ткани, уменьшению жировой прослойки и ускорению восстановления работоспособности. Перспективы использования ГР в качестве допинга были описаны еще в 1982 году и после нескольких инцидентов приема препаратов ГР, он был включен в 1989 году в Запрещенных список, несмотря на отсутствие официально принятого метода определения. Как и все лекарственные препараты пептидной природы, ГР характеризуется протеолитической нестабильностью и низкой биодоступностью, поэтому начиная с конца XX столетия активно ведутся поиски его аналогов с более простой химической структурой. Подобными аналогами являются соединения класса рилизинг-пептидов гормона роста, (от англ. Growth hormone releasing peptides, GHRP), которые увеличивают концентрацию ГР путем стимуляции его выработки при связывании с рецептором грелина GHS-Ral в гипофизе (Рис. 1). Данные соединения включены в Секцию S2 «Пептидные гормоны, факторы роста, подобные субстанции и миметики» Запрещенного списка Всемирного антидопингового агентства (ВАДА).
GHRP-1 GHRP-2 GHRP-4 GHRP-5 GHRP-6
алексаморелин гексарелин ипаморелин
Рисунок 1 —
Ala — His (D-y?-Nal) Ala Trp (D-Phe) — Lys — NH2 (D-Ala) (D-y?-Nal) Ala Trp (D-Phe) — Lys — NH2
(D-Trp) Ala Trp (D-Phe) NH2
Tyr (D-Trp) Ala Trp (D-Phe) NH2
His (D-Trp) Ala Trp (D-Phe) — Lys — NH2
Ala — His (D-Mrp) Ala Trp (D-Phe) — Lys — NH2
His (D-Mrp) Ala Trp (D-Phe) — Lys — NH2
Aib — His (D-yS-Nal) (D-Phe) — Lys — NH2
Аминокислотные последовательности наиболее популярных представителей группы GHRP
Для идентификации GHRP разработаны методики с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) и конкурирующего связывания в присутствии изотопно меченого природного агониста грелина (1251-грелин) с рецептором GHS-Ral, экспрессированного на поверхности клеток HEK293. В современном антидопинговом контроле применяется метод ВЭЖХ-МС/МС, позволяющий селективно идентифицировать большое количество соединений и их метаболитов в ходе одного анализа. Препараты пептидной природы в организме человека подвержены быстрой деградации, часто настолько стремительной, что исходное соединение не детектируется в биологических жидкостях уже через 24 часа после приема. Поэтому
особый интерес представляет идентификация метаболитов GHRP, что может увеличить временное окно детектирования после приема и достоверность идентификации данного вида допинга. Поскольку многие из GHRP не разрешены к приему человеком, информация о путях их биотрансформации в человеческом организме ограничена данными, полученными с использованием моделей in vitro и in vivo в экспериментах на крысах и лошадях. Таким образом, выявление диагностически ценных метаболитов GHRP, полученных при использовании релевантных in vitro моделей и подхода in vivo, является актуальной и важной задачей при разработке эффективного способа определения GHRP в биожидкостях человека в целях антидопингового контроля.
Цели и задачи исследования
Цель настоящей работы заключается в оценке эффективности прогнозирования образующихся в организме человека метаболитов GHRP с использованием различных подходов in vitro и in vivo при разработке эффективного способа качественного их определения методом сверхвысокопроизводительной высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (СВЭЖХ-МС/МС) для антидопингового контроля.
Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач:
-
Изучение метаболитов GHRP, полученных с использованием различных моделей in vitro: протеолитические ферменты, человеческая плазма крови, микросомы почек и печени, S9 фракция печени человека.
-
Идентификация метаболитов GHRP в моче человека, образовавшихся in vivo после назального приема волонтерами пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелин и ипаморелин.
-
Сравнение эффективности изученных моделей in vitro и выявление оптимальных для моделирования процессов биотрансформации допинговых пептидных соединений в организме человека.
-
Выбор наиболее интенсивных и долгоживущих диагностически ценных метаболитов GHRP с целью их мониторинга для определения фактов злоупотребления данным видом допинга.
-
Разработка способа хроматомасс-спектрометрического определения метаболитов GHRP в образцах мочи человека. Проведение валидации разработанной методики с определением следующих метрологических характеристик: селективность/специфичность, предел обнаружения (ПО), линейность, прецизионность в условиях одного дня и между днями, а также оценка степени извлечения анализируемых соединений и влияния матрицы.
-
Апробация разработанного способа для определения времени детектирования GHRP и их метаболитов после приема и оценки влияния
индивидуальных особенностей человеческого организма и разных способов приема GHRP на их метаболизм после назального и внутривенного введения некоторых представителей этого класса.
Научная новизна работы
В диссертации представлены результаты исследования метаболизма GHRP с использованием различных in vitro моделей, показана эффективность модельных систем in vitro микросомальной почечной и S9 печеночной фракций человека.
Выявлены закономерности биотрансформации in vivo 5 наиболее широко известных препаратов GHRP в человеческом организме (для 4 из 5 препаратов – впервые).
На основе полученных результатов разработан хроматомасс-
спектрометрический способ определения метаболитов GHRP для выявления и предотвращения использования данного вида допинга в спорте. Разработанная методика позволяет выявлять случаи злоупотребления GHRP, в том числе быстро метаболизирующими представителями данного класса.
Впервые детектирован самый долгоживущий из описанных ранее метаболитов GHRP-1 (2-4) ОН, мониторинг которого позволяет выявлять случаи злоупотребления GHRP-1, который не обнаруживается в моче в исходном виде.
Проведена оценка влияния физиологических особенностей человеческого организма и способов приема на метаболизм GHRP (на примере приема препаратов GHRP-2 и GHRP-6), показана эффективность включения метаболитов в антидопинговую методику.
Теоретическая и практическая значимость работы
Сравнение различных in vitro моделей метаболизма GHRP показало, что
печеночная S9 и почечная микросомальная фракции человека являются наиболее
эффективными моделями для моделирования процессов трансформации биоактивных
пептидов и прогнозирования образующихся в организме человека метаболитов.
Детектирование метаболитов после назального введения наиболее популярных GHRP
(in vivo метод исследования) позволило оценить выбранную in vitro модель
метаболизма и получить сведения о наиболее интенсивных и долгоживущих
диагностически значимых метаболитах. Полученные данные легли в основу способа
определения исходных веществ и метаболитов GHRP в биологических жидкостях
человека. Определение метаболитов GHRP увеличило временное окно детектирования
после приема допинга и достоверность идентификации, что особенно актуально для
GHRP-1 и алексаморелина ввиду их быстрой деградации. Разработанный способ
валидирован в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и внесен в
область аккредитации (шифр SOP P1.016) Федерального государственного
бюджетного учреждения «Антидопинговый центр» (ФГБУ АДЦ). Опыт успешного применения предложенного способа определения GHRP и их метаболитов позволил специалистам ФГБУ АДЦ выявить случаи злоупотребления соединениями данного класса спортсменами.
Положения, выносимые на защиту
-
Выбор оптимальных моделей in vitro для моделирования процессов биотрансформации допинговых пептидных соединений в организме человека.
-
Выявление наиболее диагностически ценных метаболитов GHRP с целью их мониторинга.
-
Способ определения GHRP и их метаболитов, выделенных из мочи человека, методом СВЭЖХ-МС/МС.
-
Изучение влияния индивидуальных особенностей человеческого организма и разных способов приема GHRP на их метаболизм после назального и внутривенного введения некоторых представителей этого класса.
Степень достоверности и апробация работы
Основные результаты исследования представлены на международных конференциях: “33rd Cologne Workshop on Dope Analysis (Manfred Donike Workshop)” (Кельн, Германия, 2014), “The 14th HUPO World Congress” (Ванквер, Канада, 2015) и III Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, Россия, 2017). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ – 4 статьи в реферируемых научных журналах и 6 в трудах конференций.
Личный вклад автора
Постановка цели и задач исследования, обобщение литературных данных, проведение научных экспериментов и оценка полученных результатов, подготовка и написание научных статей в соавторстве выполнены лично автором.
Структура и объем работы
Заболевания, связанные с нарушением секреции гормона роста
Биологическое действие ГР включает разнообразные метаболические и анаболические эффекты: стимуляция соматического роста, участие в водно-солевом обмене (удержание ионов натрия, фосфора и азота в организме), модуляция иммунного ответа, белкового, углеводного и липидного обменов в организме человека [3,20]. Физиологическое действие ГР начинается со связывания молекулы ГР с внеклеточным доменом своего рецептора GHR (от англ. Growth hormone receptor) цитокинового семейства с последующей активацией тирозиновой протеинкиназы JAK2 (Janus kinase 2). Активация запускает сигнальный каскад с участием различных сигнальных белков, что, в конечном счете, приводит к транскрипции генов, кодирующих инсулиноподобные факторы роста-1 и -2 (ИФР-1, ИФР-2), ИФР-связывающий белок-3 (ИФР-СБ-3) и кислотно-лабильную субъединицу (ALS, от англ. acid-labile subunit) [21]. Несмотря на то, что многие эффекты ГР оказывает напрямую, значительная их часть опосредуется действием инсулиноподобных факторов роста, в основном ИФР-1.
Секреция ГР носит пульсативный характер и регулируется двумя гормонами антагонистами: соматостатином и гипоталамическим рилизинг-гормоном гормона роста (GHRH, от англ. Growth Hormone Releasing Hormone), которые формируют внутренний гипоталамо-соматотрофный ритм [22]. Ряд других соединений (свободные жирные кислоты, некоторые аминокислоты, глюкокортикоиды, нейропептиды, глюкоза и некоторые гормоны) оказывают регуляторное действие на секрецию ГР на гипоталамусном и гипофизарном уровнях [23]. Одной из таких регуляторных молекул является пептидный гормон желудка грелин, о котором более подробно будет рассказано ниже [3].
Заболевания, связанные с нарушением секреции гормона роста Как было сказано ранее, ГР оказывает влияние на многочисленные процессы в организме, нарушение его секреции вызывает серьезные патологии в соматической, психо-эмоциональной сферах, что сказывается на показателях физической формы. Стимуляция соматического роста, особенно в детском и юношеском возрасте, является одной из основных функций ГР. При недостатке ГР развивается задержка роста, физического и полового развития. Причинами недостаточности ГР могут быть первичная недостаточность самого соматотропина и периферическая нечувствительность к нему (дефекты генов рецепторов ГР и ИФР-1, неактивная форма соматостатина и так далее) [24]. Дефицит соматотропина можно восполнить с применением двух различных подходов: заместительной терапии и стимулирующей терапии.
При заместительной терапии препараты ГР принимаются в течение всей жизни. До 1987 года единственным источником соматотропина человека были ткани гипофиза умерших или погибших людей, из которых экстрагировался гормон [3]. Ограниченность в ресурсах биосырья, а также риск развития болезни Крейцфельда-Якоба, повлекшей несколько летальных исходов, стало основанием официального запрета применения экстрагированного человеческого ГР в 1985 году. Одним из достижений генной инженерии в 1980-ых годах стало получение первых синтетических аналогов человеческого соматотропина. С тех пор препараты рекомбинантного ГР представляют основу заместительной терапии.
Альтернативным подходом является стимулирующая терапия, при которой уровень соматотропина в организме человека повышается косвенно через механизмы регуляции его секреции. Регуляция секреции ГР осуществляется двумя основными гормонами: соматостатином (супрессирующий эффект) и GHRH (стимулирующий эффект) [3]. GHRH, состоящий из 44 аминокислотных остатков, синтезируется дугообразными ядрами гипоталамуса и участвует в регуляции секреции ГР путем связывания со своим G-белок связанным рецептором GHRH-R (от англ. Growth Hormone Releasing Hormone Receptor) [3]. К настоящему времени разработаны модифицированные аналоги природного GHRH: серморелин, соответствующий фрагменту (1-29) человеческой 44-аминокислотной изоформы GHRH (торговое название Geref, Serono Laboratories), тезаморелин (торговое название Egrifta, Theratechnologies), CJC-1295, представляющий собой фрагмент (1-29) человеческого GHRH с 4 аминокислотными заменами, CJC-1295-DAC. Применение рекомбинантного GHRH и его аналогов для стимуляции секреции соматотропина нецелесообразно в виду дороговизны получения, протеолитической нестабильности, низкой биодоступности и других свойств, свойственным всех лекарственным препаратам пептидной природы. Поэтому в конце прошлого столетия активно велись поиски стимуляторов выработки ГР с более простой структурой [5]. В настоящее время перспективно использование низкомолекулярных стимуляторов выработки ГР, в том числе пептидной природы, которые осуществляют потенцирование секреции гормона через альтернативный путь – рецептор грелина.
В 1970-ых годах была доказана независимая от GHRH стимуляция выработки соматотропина аналогами энкефалина, что свидетельствовало о существовании альтернативного механизма регуляции. После этого, наряду с активными разработками наиболее эффективных стимуляторов, начались поиски самого триггерного «звена» – рецептора, через который осуществляется стимуляция, и его природного агониста [25–30].
С использованием различных технологий установлено, что «ключевым звеном» альтернативного механизма стимуляции секреции ГР является рецептор, получивший название рецептора секретагогов гормона роста GHS-R (от англ. Growth-hormone Secretagogues receptor) и относящийся к семейству G-белок связанных рецепторов [31–35]. Описаны две изоформы данного рецептора a1- и b1-типов: GHS-Ra1 и GHS-Rb1, соответственно. Позже, в 1999 году, идентифицировали природный агонист рецептора GHS-Ra1, представляющий собой гормон пептидной природы грелин, синтезирующийся в желудке и в некоторых других органах: гипоталамусе, яичках, плаценте. Агонисты к рецептору GHS-Rb1 до сих пор не выявлены.
Грелин состоит из 28 аминокислотных остатков, один из которых ацилирован остатком каприловой кислоты (Ser3, С8:0). При сравнении биологической активности природного и дезацилированного грелинов показано, что данная модификация является функционально значимой. В то же время, последний является не единственной из минорных форм ацилированного грелина.
Многочисленными опытами показано прямое и косвенное влияние грелина на регуляцию секреции соматотропина. Таким образом, грелин является дополнительным гормоном выработки ГР. Биохимические эффекты грелина не ограничиваются его природой агониста к рецептору GHS-Ra1, желудочный гормон также участвует в регуляции высвобождения ряда других гормонов (АКТГ, пролактина, возможно, инсулина и лютеинизирующего гормона), обладает анаболическим эффектом, влияет на работу желудка и сердечнососудистой системы и участвует в модуляции иммунной системы [35–38].
Аналитические подходы идентификации метаболитов
С-амидирование представляет собой замену С-концевой карбоксильной группы на амидную [111]. В природе амидирование С-концевых аминокислотных остатков широко распространено у высших эукариот, в живых организмах этот процесс происходит ферментативным N-окислением концевого остатка прогормона под воздействием ферментов пептидилглицин-а-амидирующей монооксигеназы и пептидил-а-гидроксиглицин а-амидирующей лиазы [112].
Амидирование препятствует С-концевой ионизации, что делает соединение более гидрофобным и положительно сказывается на связывании с рецептором [111]. Большая часть гормонов пептидной природы имеют модифицированный С-конец, необходимый для их полноценной активности: substance Р, нейропептид Y, окситоцин, вазопрессин, гастрин и так далее, также эта модификация встречается в структуре многих конотоксинов, противомикробных пептидов. Помимо усиления биоактивности, одной из его функцией является защита С-конца молекулы от экзопептидаз, что увеличивает устойчивость соединений пептидной природы [113].
Дезамидирование С-концевой амидной группы представляет собой триггерное значение в метаболической деградации соединений с подобной модификацией. Например, метаболизм антагониста G со структурой Arg(Drp)(N-Me)Phe(D-Тф)LeuMet-NH2 инициируется ферментативным дезамидированием С-концевого аминокислотного остатка с образованием метаболита Arg(Drp)(N-Me)Phe(Drp)LeuMet-ОН, который затем подвергается воздействию карбоксипептидазы с образованием метаболита Arg(Drp)(N-Me)Phe(Drp)Leu-ОН [82]. Сообщено о нескольких ферментах, осуществляющих дезамидирование, сериновая карбоксипептидаза среди них является наиболее распространенной [82,114,115].
Все представители класса GHRP включают С-концевую амидную группу, которая защищает соединения от карбоксипептидаз и выполняет функциональную роль, придавая дополнительный положительный заряд молекуле, необходимый для лучшей аффиности к грелиновому рецептору. В работах [116,117] описаны метаболиты, полученные в процессе инкубации с ферментами рекомбинантой амидазой и химотрипсином, соответственно. Однако деамидированные метаболиты в экспериментах in vivo и in vitro с субклеточными фракциями не выявлены.
В фармакологической промышленности около 50% всех терапевтических препаратов пептидной природы в качестве С-концевой защитной и функциональной группы имеют амидную группу [118]. N-ацилирование СООН-карбоксиамидной группы - новая стратегия увеличения стабильности и гидрофобности пептидных соединений, которая была применена при разработке аналогов гонадолиберина, например, молекула трипторелина имеет С-концевую этил-амидную группу [119].
N-ацилирование представляет собой процесс присоединения карбоксильной группы остатка жирной кислоты к аминогруппе аминокислотного остатка, как правило, модифицируют а-аминогруппу N-концевой аминокислоты, однако известны случаи и С-концевого ацилирования. Данная модификация уже рассматривалось выше при замене аминокислот на N-ацилированные производные.
Помимо введения стерических препятствий в сайтах узнавания протеолитических ферментов, ацилирование нестабильных белков и пептидов используется для их нековалентного присоединения к альбумину. Человеческий сывороточный альбумин имеет молекулярную массу около 67 кДа и является наиболее распространенным белком сыворотки крови, период полураспада которого составляет 19 дней. При присоединении биоактивного пептида к альбумину увеличивается общая молекулярная масса комплекса, в результате чего пептид не выводится из организма посредством почечной клубочковой фильтрации. Кроме того, значительный вклад в увеличение периода полураспада ассоциированного белка вносит связывание альбумина с неонатальным Fc-рецептором [120]. Классическими примерами увеличения стабильности белков ацилированием являются лираглутид и детемир (торговое название Левемир, NovoNordisc). Детемир представляет собой аналог инсулина длительного действия, в котором С-концевым аминокислотным остатком В-цепи является ацилированный миристиновой кислотой лизин (Lys B29). Присоединение детемира к альбумину через остаток жирной кислый увеличивает период его полураспада до 5-7 ч [88].
N-концевое ацилирование фрагмента (17-23) тимозина 4 (торговое название ТВ-500), разработанного для применения в ветеринарных целях, защищает соединение от карбоксипептидаз, как это было показано в ряде работ по изучению метаболизма ТВ-500 с использованием различных модельных систем in vivo и in vitro [117,121,122].
Существенным ограничением применения ацилирования для защиты соединений пептидной природы от экзопептидаз является отсутствие конформационной стабильности концевых областей биомолекулы, что может сказываться на ее активности. Альтернативной стратегией модифицирования белков и пептидов является гибридизация белков с N- или С-концевым белком носителем в виде самого альбумина или высоко аффинных к нему молекул, в том числе небольших размеров. Недостатком данной стратегии является потенциальная иммуногенность [123].
Синтез метаболитов GHRP в условиях in vitro
В зависимости от соотношения количеств протеолитического фермента и субстрата (исходного пептида) в процессе инкубации образовывались различные наборы метаболитов. Однако прямой зависимости между соотношением количества протеолитического фермента и субстрата, а также специфичностью протеолитического фермента и химической структурой исходного соединения не выявлено. Большинство использованных протеолитических ферментов не продемонстрировали явной специфичности, расщепляя молекулы исходных соединений по неспецифическим сайтам расщепления. Показано, что эндопротеаза Lys C катализировала гидролиз пептидных связей между аминокислотными остатками AlaHis, Ala(D--Nal), Tyr(Drp) и замену NH2-группы на ОН-группу С-концевого аминокислотного остатка Lys. Протеолитические ферменты rhCPB, rhCPM и rhAPN продемонстрировали большее разнообразие расщепляемых пептидных связей между аминокислотными остатками AlaHis, Ala(D--Nal), Tyr(Drp), (D--Nal)Ala, AlaTrp, (D-Phe)Lys, (Drp)Ala, (D-Mrp)Ala, His(D--Nal), His(Drp) с некоторыми дополнениями, заключающимися в реакции замещения NH2-группы на ОН-группу С-концевого аминокислотного остатка Lys в случае пептидаз rhCPB и rhAPN и расщеплении связи His(D-Mrp) пептидазой rhAPN. Лейциновая аминопептидаза, выделенная из свиной почки, катализировала гидролитическое расщепление пептидных связей между аминокислотными остатками AlaHis, Tyr(D-Phe), AlaTrp, в то время как панкреатическая бычья СРВ – Ala(D--Nal), Tyr(Drp), (D--Nal)Ala, AlaHis, (D-Phe)Lys, соответственно. Показано, что ферменты катализировали гидролитическое расщепление связи в одном соединении, но не катализировали протеолиз по этой же связи в другом. Например, эндопептидаза Lys C осуществляла гидролиз между аминокислотными остатками Ala и His в соединениях GHRP-1 и GHRP-2, но не воздействовала на аналогичную связь в алексаморелине. Корреляции составов смесей метаболитов, полученных с использованием ферментов одного класса, но выделенных из разных источников, например, рекомбинантной человеческой и бычьей панкреатической карбоксипептидаз В, так же отмечены не были. Стоит отметить, что рекомбинантные человеческие протеолитические ферменты, полученные генно-инженерными методами, по сравнению с выделенными из биосырья ферментами, показали большую протеолитическую активность, заключающуюся в заметном разнообразии полученных метаболитов. На Рисунке 11 схематически изображены аминокислотные последовательности GHRP с указанием сайтов, по которым происходило гидролитическое расщепление под воздействием различных протеолитических ферментов. Все детектированные метаболиты, образовавшиеся в серии экспериментов с каждой протеазой, приведены в Таблице 8. Lys C rhCPB rhAPN Lys — NH2
Схематичное изображение аминокислотных последовательностей GHRP с указанием сайтов расщепления протеолитическими ферментами (А) и специфические сайты расщепления использованных протеаз, согласно литературным данным (Б) [156] Таблица 8 — Элементный состав, точные массы ионов-прекурсуров исходных пептидов и метаболитов, синтезированных в условиях in vitro в присутствии протеолитических ферментов: эндопептидазы Lys C, бычьей панкреатической карбоксипептидазы В (CPB), человеческой рекомбинантной карбоксипептидазы В (rh CPB), человеческой рекомбинантной карбоксипептидазы М (rh CPM), лейциновой аминопептидазы (Leu-AP), человеческой рекомбинантной аминопептидазы N (hr APN)
Белки и пептиды характеризуются низкой мембранной проницаемостью ввиду их гидрофильных свойств и быстрой деградацией в организме, что сокращает их терапевтический потенциал и значительно сужает спектр возможных способов приема. Биодоступность пептидных препаратов при самом удобном пероральном способе приема очень низкая [36,41], поэтому внутривенное введение – один из потенциальных способов приема GHRP.
Плазма является жидкой составляющей крови организма и содержит большое количество различных ферментов, участвующих в биотрансформации пептидных соединений. Альтернативным вариантом изучения метаболизма соединений, запрещенных к применению в спорте, является инкубация в сыворотке и/или плазме крови человека или подопытного животного.
Метаболизм соединений класса GHRP был изучен в сыворотке и плазме крови человека [116,117] и лошадей [6,121]. В работе [116] представлены данные по метаболизму восьми GHRP в сыворотке человеческой крови, однако из работы не очевидно, в каком из экспериментов идентифицированы те или иные метаболиты, поскольку в исследовании также представлены результаты экспериментов изучения метаболизма GHRP в условиях in vivo после внутривенной инъекции пептидов крысам. В статье [117] описаны 10 метаболитов GHRP-2, GHRP-6 и гексарелина, полученные при их инкубации с человеческой сывороткой крови. Согласно данным [6], при инкубации с лошадиной сывороткой крови большинство GHRP идентифицируются в неизменном виде, в то время как алексаморелин и GHRP-1 претерпевают протеолитическое расщепление с высвобождением N-концевого аминокислотного остатка. Значительная деградация GHRP-1 при инкубации с лошадиной плазмой крови также отмечается в работе [121] при изучении устойчивости некоторых соединений GHRP. Авторы предполагают, что метаболит GHRP-1 (2-7) NH2 образуется в результате ферментативного гидролиза GHRP-1 с участием экзопептидаз или дипептилпептидазы V лошадиной плазмы. Полный катаболизм GHRP-1 и алексаморелина, в отличие от остальных представителей класса GHRP по мнению авторов [6,7] происходит за счет присутствия незащищенной искусственными аминокислотами пептидной связи AlaHis в первом положении.
Для определения эффективности модельной системы in vitro с использованием сыворотки человеческой крови в качестве матрицы использовали смесь сыворотки крови здоровых мужчин и женщин, взятых в равных соотношениях. Каждый из исходных GHRP инкубировали с сывороткой в течение 24 ч при условиях, описанных в разделе 2.4.3.2. После пробоподготовки инкубационных смесей путем осаждения органическим растворителем мажорных белков, образцы анализировали методом наноВЭЖХ-МСВР в режиме tSIMMSMS.
Анализ полученных образцов показал, что основным катаболическим процессом для соединений класса GHRP является протеолитическая деградация. Присутствие исходных соединений GHRP-1 и алексаморелина в следовых количествах коррелирует с другими публикациями [6,7], в которых описана полная деградация данных пептидов с образованием амидированных метаболитов GHRP-1 (2-7) NH2, GHRP-1 (3-7) NH2 и алексаморелина (2-7) NH2. Идентификация пептидов GHRP-1 и алексаморелина в интактном виде может объясняться высокой чувствительностью методов анализа и/или избытком исходных соединений в реакционных смесях. Таким образом, для GHRP-1, алексаморелина и GHRP-5 превалирует N-концевое направление метаболической деградации, в то время как для остальных исследованных GHRP – С-концевое. Анализ сайтов протеолитического гидролиза показал присутствие дополнительной уязвимой пептидной связи между аминокислотными остатками L-Ala и Trp [5]. Метаболиты, идентифицированные после инкубации GHRP с плазмой крови человека, представлены в Таблице 9.
Оценка влияния особенностей метаболизма на биотрансформацию соединений после назального и внутривенного введения GHRP-2 и назального приема GHRP-6
В настоящее время для стимулирующей терапии при дефиците ГР разрешен только GHRP-2 на территории Японии. Данные по его метаболизму in vivo в человеческом организме получены при внутривенном введении, после назального и перорального приемов [7,147,175]. В работах [147,175] после внутривенного введения 100 мкг пралморелина дигидрохлорида (GHRP-2) десяти волонтерам мужского пола в моче идентифицирован метаболит GHRP-2 (1-3) ОН, соответствующий первым трем N-концевым аминокислотам GHRP-2. При анализе образцов мочи через 20 ч после перорального приема 100 мкг GHRP-2 также был идентифицирован метаболит GHRP-2 (1-3) ОН при отсутствии исходного соединения [7].
В работах [6,116] представлены данные по изучению метаболизма соединений класса GHRP in vivo путем анализа мочи крыс после внутривенной инъекции пептидов. В работе [116] подробно описан метаболизм GHRP-2 с указанием амидированного и деамидированного метаболитов GHRP-2 (1-3) NН2 и GHRP-2 (1-3) ОН, соответственно. При анализе GHRP и их основных метаболитов в сыворотке крови авторы работы [6] описали амидированные метаболиты GHRP-1 (2-7) NН2 и GHRP-1 (3-7) NН2, GHRP-6 (2-6) NН2 и GHRP-5 (2-5) NН2. Из представленных данных очевидно, что информации о метаболизме GHRP in vivo недостаточно для четкого предсказания образующихся их метаболитов в организме человека.
В нашем исследовании принимали участие 5 здоровых волонтеров мужского пола европеоидной расы, которым назальным способом вводили один из пептидов (GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин). Объектом исследования была моча волонтеров, собранная разово до введения препарата и в течение 48 ч после приема. Детали приема пептидов описаны в разделе 2.4.6.1. Подробное описание пробоподготовки и анализа образцов мочи хроматомасс-спектрометрическими методами приведено в разделах 2.4.4.1 и 2.4.1–2.4.2, соответственно. Концентрации растворов калибровочной прямой составляли 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 и 10.0 нг/мл. При анализе проб мочи после приема GHRP-2 методом наноВЭЖХ-МСВР идентифицированы 2 метаболита: описанный ранее метаболит GHRP-2 (1-3) ОН и деамидированный метаболит GHRP-2 (1-6) ОН, интенсивность сигнала которого была примерно в 10 раз ниже, чем исходного пептида. Деамидированный метаболит GHRP-2 (1-6) ОН не был детектирован ранее после внутривенного приема волонтерами монголоидной расы [147]. Причинами этого могут быть иной путь введения и расовые особенности метаболизма у волонтеров монголоидной и европеоидных рас. Однозначно установить это можно в исследовании с большим числом добровольцев. Только один из двух идентифицированных метаболитов был признан диагностически значимым. Деамидированный метаболит GHRP-2 (1-6) ОН характеризовался низкой интенсивностью сигнала и детектирование его двухзарядного иона масс-спектрометром низкого разрешения затруднительно ввиду совпадения значения m/z первого изотопа двухзарядного иона со вторым изотопом двухзарядного иона-прекурсора исходного соединения. Более того, ранее показано [147,175], что метаболит GHRP-2 (1-3) ОН детектируется в моче дольше, чем исходное соединение. Это стало дополнительным основанием для его включения как диагностически значимого в разрабатываемую методику определения метаболитов GHRP.
При анализе проб мочи после приема GHRP-6 помимо исходного соединения идентифицировали два его деамидированных метаболита GHRP-6 (1-6) ОН, GHRP-6 (2-6) ОН, GHRP-6 (2-5) ОН и GHRP-6 (2-6) NH2. Согласно полученным данным, GHRP-6 экскретировался в основном в неизменном виде, интенсивность сигнала детектированных метаболитов по сравнению с исходным соединением была ниже в 10–50 раз. Таким образом, аналогично GHRP-2, злоупотребление GHRP-6 можно определить идентификацией характеристичных ионов исходного соединения. В то же время, присутствие метаболитов в образце может быть использовано в качестве дополнительного доказательства приема допинга, а также может указывать предположительное время после приема пептида. С учетом использования масс-спектрометра низкого разрешения при выполнении рутинных анализов в качестве диагностически значимых метаболитов были выбраны метаболиты GHRP-6 (2-6) NH2 и GHRP-6 (2-5) ОН.
Деамидированный метаболит GHRP-6 (2-6) ОН детектирован методом наноВЭЖХ-МС/МС в следовых количествах, возможно, из-за его более слабой ионизации в режиме положительной ионизации ввиду отсутствия дополнительной NH2-группы на С-конце. Анализ проб мочи после приема гексарелина и ипаморелина показал интенсивный метаболизм этих препаратов с образованием деамидированных метаболитов гексарелин (1-6) ОН и ипаморелин (1-5) ОН и метаболитов, образованных протеолитическим гидролизом пептидных связей гексарелин (2-5) ОН, гексарелин (1-3) ОН и ипаморелин (1-4) ОН, соответственно. Временное окно детектирования метаболитов гексарелин (1-3) ОН и ипаморелин (1-4) ОН было шире, чем окно детектирования исходных соединений, поэтому данные метаболиты также признаны диагностически значимыми. С точки зрения антидопингового контроля особый интерес представляют гептапептидные соединения GHRP-1 и алексаморелин, не такие распространенные на черном рынке, как предыдущие пептиды, но крайне метаболически нестабильные, согласно литературным источникам [6,116]. Поскольку образующийся при отщеплении N-концевой аминокислоты метаболит алексаморелин (2-7) по структуре представляет собой гексарелин, изучать метаболизм алексаморелина отдельно нецелесообразно.
При анализе проб мочи волонтера после приема препарата показана полная деградация GHRP-1 с образованием 6 метаболитов: амидированные и деамидированные метаболиты GHRP-1 (2-7) и GHRP-1 (3-7) , а также GHRP-1 (3-6) ОН и GHRP-1 (2-4) ОН. Метаболит GHRP-1 (2-4) ОН описан впервые, был наиболее долгоживущим и детектировался до 27 ч после приема препарата. Деамидированные метаболиты GHRP-1 (2-7) ОН, GHRP-1 (3-7) ОН и GHRP-1 (3-6) ОН детектированы методом наноВЭЖХ-МСВР в следовых количествах, поэтому в дальнейших исследованиях не рассматривались.