Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 13
1.1. Роль химио- и таргетной терапии в лечении опухолей мозга 13
1.2. Гематоэнцефалический барьер
1.2.1. Особенности строения и транспортных механизмов ГЭБ 18
1.2.2. Способы доставки лекарственных средств в мозг 21
1.2.3. Методы оценки способности веществ преодолевать ГЭБ 25
1.3. Опухолевый супрессор р53 34
1.3.1. Строение и функции р53 34
1.3.2. Регуляция активности р53 35
1.3.3. Ингибиторы MDM2 37
1.4. Заключение 44
ГЛАВА 2. Обсуждение результатов 45
2.1. Выбор объектов исследования 45
2.2. In silico изучение влияния мембранотропных заместителей на целевую активность и способность веществ преодолевать ГЭБ 47
2.3. Синтез соединений 53
2.4. Разработка in vitro метода для сравнительного анализа способности веществ преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ 57
2.5. Способность 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов преодолевать мембраны 64
2.6. Валидация метода оценки способности изоиндолинонов провоцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток 66 2.7. Cпособность изоиндолинонов провоцировать р53-опосредованный апоптоз 67
2.8. Выделение и целевая активность диастереомеров 2,3-замещенных
3-гидроксиизоиндолинонов 71
2.9. Целевая активность диастереомеров 2,3-замещенных 3 гидроксиизоиндолинонов 78
2.10. Модификация производного 3-иминоиндолинона 80
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 85
3.1. Выбор объектов исследования 85
3.2. Расчетные методы
3.2.1. Липофильность и растворимость веществ 85
3.2.2. Способность веществ преодолевать ГЭБ 86
3.2.3. Способность веществ взаимодействовать с р53-связывающей полостью MDM2 86
3.2.4. Квантово-химические расчеты ЯМР спектров 87
3.3. Синтез производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона 87
3.3.1. Химические реактивы и оборудование 87
3.3.2 Получение простых эфиров 2,3-замещенных 88
3-гидроксиизоиндолин-1-онов 88
3.3.3 Получение сложных эфиров 2,3-замещенных изоиндолин-1-онов 94
3.4. Оценка мембранотропности соединений с использованием искусственных мембран 124
3.4.1. Состав искусственных мембран 124
3.4.2. Метод РАМРА 124
3.4.3. Расчет величин Са и logPe 125
3.5. Оценка биологической активности веществ 126
3.5.1. Использованные клеточные линии 126
3.5.2. Подготовка клеточных культур и исследуемых веществ 126
3.5.3. Клеточный скрининг 127
3.5.4. Влияние исследуемых веществ на уровень белков р53 и MDM2 127
3.5.5. Исследование апоптоза методом проточной цитометрии 128
Заключение 129
Список использованной литературы
- Особенности строения и транспортных механизмов ГЭБ
- Разработка in vitro метода для сравнительного анализа способности веществ преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ
- Липофильность и растворимость веществ
- Оценка биологической активности веществ
Введение к работе
Актуальность темы. По данным 2015 года, у 35-50% больных со злокачественными
опухолями развиваются метастазы в головном мозге (МГМ), причем в лучшем случае треть
из них имеют симптомы, позволяющие осуществить своевременную диагностику. Рост числа
выявленных метастатических поражений обусловлен как успехами онкотерапии,
способствующей увеличению продолжительности жизни больных, так и
усовершенствованием методов диагностики первичных и метастатических опухолей.
Основным препятствием для лекарственного лечения МГМ является наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), который контролирует попадание в мозг различных ксенобиотиков, в частности, лекарственных препаратов. Малые, неполярные, гидрофобные молекулы, в том числе многие потенциальные лекарства, преодолевают барьер в основном по механизму пассивной диффузии сквозь мембраны эндотелиоцитов ГЭБ.
В лечении некоторых МГМ (рака легкого, почек, меланомы) нашли применение отдельные ингибиторы киназ и моноклональные антитела; используется и темозоломид, известный своими побочными действиями. Однако эффективность современных препаратов, направленных на борьбу с метастазами, оставляет желать лучшего.
Схема лекарственного лечения МГМ определяется структурой и свойствами первичной опухоли, а также схемой противоопухолевой лекарственной терапии, проведенной до выявления метастазов. Химиотерапия МГМ имеет смысл, только если первичная опухоль не проявляет резистентности к конкретному препарату, но даже в этом случае лечение может быть неэффективным, если действующее вещество не способно преодолевать ГЭБ.
За последние годы создание реактиваторов проапоптотического белка р53 стало одним из ключевых направлений в разработке таргетных противораковых препаратов. Известно, что развитие онкологических заболеваний обусловлено, в частности, подавлением активности этого белка за счет связывания с Е3-лигазой MDM2.
Таким образом, при создании препаратов для лечения МГМ представляется
актуальным подход, основанный на рациональной структурной оптимизации
низкомолекулярных противораковых агентов, в том числе ингибиторов взаимодействия MDM2-р53, для повышения способности активных соединений преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ.
Степень разработанности темы. В настоящее время идет активное развитие противораковых агентов, механизм действия которых основан на реактивации проапоптотического белка р53 за счет ингибирования его взаимодействия с лигазой MDM2. Большой объем информации о функции и структуре этих белков позволяет осуществлять
рациональную разработку препаратов и на каждом этапе последовательно оптимизировать структуры соединений с учетом новых знаний. В качестве ингибиторов MDM2 заявлены представители различных классов – цис-имидазолины, изоиндолиноны, спирооксиндолы и др. Однако, несмотря на многолетнюю работу, ни один из них не дошел до клинического применения. На I стадии клинических испытаний находятся два ингибитора от Hoffmann-La Roche (III стадию испытаний против миелоидного лейкоза проходит идазанутлин), а также кандидаты от Novartis Pharmaceuticals и M.D. Anderson Cancer Center. При этом ни один из них не заявлен для борьбы с МГМ. С 2012 года разработкой низкомолекулярных ингибиторов взаимодействия MDM2-p53 занимается НИЛ «Молекулярная фармакология», созданная на базе СПбГТИ(ТУ) под руководством Дженнаро Мелино в рамках реализации гранта №11.G34.31.0069 Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских ВУЗах.
Цель диссертационного исследования: создание мембранотропных реактиваторов белка р53 на основе исследования белок-белкового взаимодействия MDM2-р53. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
- идентификация структурных модификаций 2,3-замещенных
3-гидроксиизоиндолинонов, повышающих их способность преодолевать ГЭБ с сохранением
оптимальных показателей ингибирования взаимодействия MDM2-р53 для последующей
оптимизации производного 3-иминоиндолинона;
- разработка и осуществление направленного синтеза новых производных
2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона;
разработка метода количественного определения способности индолинонов и изоиндолинонов преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ; in silico и in vitro изучение влияния модифицирующих заместителей на мембранотропность производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона;
разработка метода количественного определения способности индолинонов и изоиндолинонов индуцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток; in silico и in vitro изучение влияния модифицирующих заместителей на целевую активность производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона;
- модификация соединений ряда 3-иминоиндолинона с использованием выявленных
мембранотропных структурных модификаций, изучение мембранотропности и целевой
активности вновь созданных соединений.
Объекты исследования: производные 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона и 3-иминоиндолинона, а также фосфолипидные мембраны, используемые для определения мембранотропности соединений.
Научная новизна. Разработан метод сравнительного анализа способности
низкомолекулярных соединений преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ, основанный
на использовании искусственных липидных мембран. Разработана методика
высокоинформативного скрининга производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона.
Впервые синтезирован ряд новых производных 2,3-замещенного
3-гидроксиизоиндолинона. Изучено влияние мембранотропных заместителей на способность
вновь синтезированных соединений преодолевать ГЭБ и индуцировать апоптоз раковых
клеток. Моделирование методом молекулярного докинга позволило объяснить участие
мембранотропных заместителей во взаимодействии 2,3-замещенных
3-гидроксиизоиндолинонов с р53-связывающей полостью белка MDM2. На основании полученных данных предложены способы оптимизации новых ингибиторов взаимодействия MDM2-р53 – производных 3-иминоиндолинона.
Установлено, что простые эфиры 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона неустойчивы в кислой среде. Показано, что, в отличие от энантиомеров 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов, диастереомеры их сложных эфиров, получаемых при реакции с N-Вoc-L-аминокислотами, могут быть выделены препаративно с использованием флэш-хроматографии на ахиральных носителях.
Теоретическая и практическая значимость. В ходе работы был синтезирован ряд производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона, которые обладают высокой способностью преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ и ингибировать взаимодействие белков MDM2-р53. Такие соединения являются более перспективными кандидатами в противораковые препараты для лечения метастатических или первичных опухолей мозга, чем исходный ряд 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов с заявленной в литературе противораковой активностью. Благодаря применению разработанного подхода оптимизирована структура представителя нового класса ингибиторов взаимодействия MDM2-р53 на основе замещенного 3-иминоиндолинона.
Предложенный в работе метод сравнительного анализа способности низкомолекулярных соединений преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ с использованием искусственных липидных мембран является универсальным и может быть использован для широкого круга объектов, обладающих достаточной растворимостью и детектируемых в УФ и видимом диапазоне, либо по флуоресценции. Он может быть использован при создании препаратов для лечения различных заболеваний, связанных с нарушениями деятельности головного мозга – как метастатических или первичных опухолей мозга, так и нейродегенеративных заболеваний. Представленный метод оценки способности веществ индуцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток может быть использован для аналогичных исследований.
Методы исследования. В работе использованы in silico и in vitro методы: молекулярный докинг и QSAR для предсказания свойств веществ, метод на основе искусственных мембран для оценки мембранотропности соединений, клеточный скрининг для оценки способности веществ индуцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток с подтверждением по связыванию аннексина V и с использованием вестерн-блоттинга. Строение и чистоту полученных в работе соединений исследовали с использованием ЯМР и ВЭЖХ-МС, для очистки продуктов использовали флэш-хроматографию.
Положения, выносимые на защиту:
- способ оптимизации ингибиторов взаимодействия MDM2-р53, основанный на
использовании мембранотропных заместителей, не снижающих целевую активность
соединений;
in vitro метод на основе искусственных липидных мембран для количественного определения способности индолинонов и изоиндолинонов преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ;
in vitro метод на основе высокоинформативного скрининга для количественного определения способности индолинонов и изоиндолинонов провоцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток;
- метод синтеза новых производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона;
применение мембранотропных заместителей, влияющих на способность производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона преодолевать мембраны ГЭБ и провоцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток;
способ оптимизации производных 3-иминоиндолинона с использованием заместителей, идентифицированных в ходе оптимизации производных 2,3-замещенного 3-гидроксиизоиндолинона; влияние модификации соединения на способность преодолевать мембраны ГЭБ и провоцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток.
Апробация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы представлены на VI научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Неделя науки - 2016» (СПб, 2016), VI Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциал будущего» (СПб, 2016), Симпозиуме "Биоинформатика и компьютерное конструирование лекарств" (Москва, 2015, в рамках XXII Российского национального конгресса «Человек и лекарство»), ХI конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (СПб, 2015, в рамках 1-ого Российского онкологического научно-образовательного форума с международным участием «Белые Ночи – 2015»), II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические аспекты
химической безопасности» (СПб, 2015), международном симпозиуме EuroQSAR-2014 (СПб, 2014), международной научной конференции «Science of the future» (СПб, 2014), VIII всероссийской конференции с международным участием молодых учёных по химии «Менделеев-2014» (СПб, 2014), VI Международной конференции молодых ученых «Органическая химия сегодня» InterCYS-2014 (СПб, 2014) и др.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ в журналах, рекомендуемых ВАК, а также материалы в сборниках тезисов конференций.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения полученных результатов и их обсуждения, описания материалов и методов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материал изложен на 152 страницах, содержит 10 таблиц и 44 рисунка. Список литературы включает 179 ссылок.
Особенности строения и транспортных механизмов ГЭБ
Одной из серьезных проблем при лечении больных с онкологическими заболеваниями является развитие метастатических поражений головного мозга [1]. В зависимости от особенностей первичной опухоли такие метастазы развиваются у 2–50% больных [1–3].
В нашей стране нет единого учёта случаев метастатического поражения ЦНС, в отличие от первичных опухолей головного мозга [4], хотя метастазы в головном мозге составляют 20–30% всех внутричерепных новообразований [5]. С каждым годом количество выявленных случаев МГМ увеличивается. Это объясняется улучшением методов диагностики и визуализации (использования высокоинформативных методов исследования, таких, как компьютерная и магнитно-резонансная томография), кроме того, современное эффективное лечение увеличивает продолжительность жизни онкологических больных, в результате чего расширяется временной диапазон для развития метастатических очагов [4, 6]. Среди злокачественных опухолей наиболее высокий метастатический потенциал имеют меланома и мелкоклеточный рак легкого, при которых за год метастазы головного мозга развиваются у 50–80% пациентов с диссеминированным процессом. При этом метастазы меланомы имеют наихудший прогноз опухолевого контроля и выживаемости [3].
По самым скромным оценкам, у 8–10% больных злокачественными опухолями развиваются симптомные метастазы в головном мозге. При этом по данным аутопсии установлено, что у 25–45% онкологических пациентов они являются бессимптомными и не диагностируются при жизни [3, 7, 8]. У 50–63% пациентов метастазы имеют множественный характер и могут локализоваться в различных анатомических образованиях мозга: в паренхиме, в твердой или мягкой мозговой оболочках, в субарахноидальном пространстве и желудочках мозга [3]. Таким образом, особенности, как первичного опухолевого очага, так и метастатических поражений являются факторами, влияющими на общую продолжительность жизни при онкологических заболеваниях.
Стандартом лечения одиночных операбельных метастазов в головном мозге является хирургическая резекция с последующим облучением всего головного мозга (ОВГМ). В случае множественных МГМ роль хирургии ограничена получением биопсии или устранением симптомов масс-эффекта, вызванных большими МГМ. Радиохирургия, являясь по сути методом лучевой терапии, позволяет осуществлять воздействия на опухоли, недоступные для классической нейрохирургии, однако ее эффект проявляется спустя месяцы, что, учитывая продолжительность жизни пациентов с МГМ, зачастую неприемлемо. Облучение всего головного мозга, хотя и уступило главенствующую роль другим методам, остается основным способом лечения как при монотерапии, так и в составе комплексной терапии нерезектабельных МГМ, множественных МГМ или в случае пациентов с плохим прогнозом [3].
Несмотря на развитие современных методов радио- и нейрохирургии, первым этапом лечения МГМ остается системная противоопухолевая терапия (химио- и таргетная терапия), особенно в случаях бессимптомных метастатических поражений головного мозга и МГМ, чувствительных к такому лечению. К последним относятся в первую очередь больные раком молочной железы при наличии гиперэкспрессии рецептора факторов роста HER2 и больные немелкоклеточным раком легкого при наличии мутации гена EGFR или транслокации киназы ALK.
Выбор схемы лекарственного лечения пациента с метастатическим опухолевым процессом в головном мозге зависит в первую очередь от морфологии первичной опухоли и ее биологических характеристик, а также от схемы противоопухолевой лекарственной терапии, проведенной до выявления метастазов в головном мозге [3]. При проведении таргетной терапии в случае изолированного метастатического поражения головного мозга или при прогрессировании опухолевого процесса в головном мозге возможно продолжение таргетной терапии в сочетании с локальным контролем опухолевых очагов в головном мозге (нейрохирургическое лечение, стереотаксическая лучевая терапия/радиохирургия, облучение всего головного мозга). Применение лекарственного лечения после хирургического вмешательства может в несколько раз увеличивать медиану общей выживаемости больных [4]. При этом изучение морфологических и биологических характеристик удаленной опухоли позволяет спланировать схему дальнейшей лекарственной терапии.
В настоящее время для лечения метастатических опухолей в зависимости от природы первичной опухоли назначают различные цитостатические/цитотоксические препараты для химиотерапии (цисплатин, гемцитабин, паклитаксел и др.) [3], и лишь в отдельных случаях – таргетную терапию: а) в случае метастазов HER2-положительного рака молочной железы применяют моноклональные антитела к рецепторам эпидермального фактора роста человека 2-го типа HER2 (трастузумаб и пертузумаб), а также лапатиниб, ингибитор внутриклеточной тирозинкиназы, связывающейся с рецепторами семейства ErbB, в том числе HER2 [9]. Таргетная терапия подобных метастазов в сочетании с химиотерапией обладает достаточно высокой эффективностью [10], но возможности лечения таких пациентов все равно остаются ограниченными [6]; б) в случае метастазов меланомы с активирующими мутациями киназы BRAF возможно использование соответствующих ингибиторов – вемурафениба и дабрафениба, рисунок 1.1 [11, 12];
Разработка in vitro метода для сравнительного анализа способности веществ преодолевать мембраны эндотелиоцитов ГЭБ
Разработанную методологию мы использовали для оптимизации ряда низкомолекулярных соединений, обладающих способностью провоцировать р53-опосредованный апоптоз раковых клеток путем ингибирования белок-белкового взаимодействия MDM2-р53: а) экспериментальный класс ингибиторов MDM2 на основе замещенного изоиндолинона (рисунок 2.2) был использован для отработки подхода в качестве опытного объекта исследований; Рисунок 2.2 – Структура производных 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов б) производное 3-иминоиндолинона (рисунок 2.3), разработанное в лаборатории молекулярной фармакологии СПбГТИ(ТУ), модифицировали для подтверждения универсальности использованных методов оптимизации ингибиторов MDM2 и собственно разработки нового активного мембранотропного соединения. Рисунок 2.3 – Структура производного 3-иминоиндолинона Для выбора опытного класса мы провели сравнение представителей нескольких классов ингибиторов белок-белкового взаимодействия MDM2-р53, разработанных на сегодняшний день [145, 150, 152, 155, 164]. Сравнение проводили по параметрам целевой активности, сложности синтеза и возможности химической оптимизации без нарушения характера взаимодействия с р53-связывающей полостью белка MDM2. Наиболее перспективным для оптимизации по критерию мембранотропности оказался класс 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов, который, как и 3-иминоиндолинон, имеет свободную гидроксильную группу. В процессе работе мы рассматривали представителей нескольких рядов 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов, различающихся заместителями Ri и R2 (рисунок 2.4). С целью повышения мембранотропности свободную гидроксильную группу исследуемых соединений этерифицировали карбоновыми и аминокислотами, в том числе с каркасными заместителями. . In silico изучение влияния мембранотропных заместителей на целевую активность и способность веществ преодолевать ГЭБ
Для оценки физико-химических свойств предложенных соединений использовали параметры, рассчитанные при помощи он-лайн сервиса ALOGPS 2.1: logP - логарифм коэффициента распределения вещества в системе октанол-вода; logS - логарифм величины растворимости вещества в воде.
Полученные результаты (таблица 2.1) показали, что все предложенные модификации, за исключением глицина, способствуют повышению липофильности соединений, причем наилучшие результаты показывают производные валина, фенилглицина и адамантилглицина.
С другой стороны, повышение липофильности связано со снижением растворимости веществ. Для идентификации допустимых значений logS мы рассчитали растворимость ряда ингибиторов MDM2, в том числе находящегося на стадии клинических испытаний RG7112 (таблица 2.1), а также некоторых лекарственных препаратов.
PASS (он-лайн сервис Way2Drug) и Percepta (ACD/Labs) использовали для оценки способности веществ попадать в ЦНС. К сожалению, Percepta оказалась непригодна для предсказаний свойств рассматриваемых соединений и не позволила сделать выводы о способности проникать в мозг как исходных, так и модифицированных соединений. PASS показал, что все рассмотренные вещества потенциально способны преодолевать ГЭБ. Кроме того, PASS также использовали для оценки возможности взаимодействия соединений с гликопротеином-Р, поскольку известно, что многие вещества, способные преодолевать мембраны, связываются с этим транспортным белком и выводятся из клетки. Как оказалось, к таким веществам относятся производные хинуклидина.
На следующем этапе мы проверили, не оказывают ли предложенные модификации отрицательного влияния на целевую активность ингибиторов. Взаимодействие белков MDM2-р53 хорошо изучено: гидрофобная полость N-концевого домена MDM2 связывает -спираль трансактивационного домена белка р53. На основе описанных в Protein Data Bank структур MDM2 мы провели молекулярный докинг (GOLD Suite v5.2.2, CCDC) низкомолекулярных соединений в гидрофобную полость белка. Поскольку в непосредственной близости от сайта взаимодействия находится высокоподвижный N-концевой фрагмент MDM2, то в работе рассматривали 3 модели белка, которые различаются положением этого фрагмента: 4HG7 (а.о. 17–125) [148], 1Z1M (а.о. 1–118) [168] и 2LZG (а.о. 1–125) [165]. Результаты представлены в таблице 2.1. Предложенные модификации не оказали отрицательного влияния на ингибиторную способность веществ, более того, сложные эфиры аминокислот показали более высокую способность связываться с р53-связывающей полостью MDM2 (возрастание значения GoldScore).
Липофильность и растворимость веществ
Важным параметром при исследовании мембранотропности является продолжительность эксперимента. В зависимости от особенностей исследуемых соединений она может изменяться в широких пределах. Для определения оптимальной продолжительности эксперимента в случае 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов была проведена серия измерений с использованием 6 временных интервалов (2, 4, 8, 16, 24 и 48 часов) и раствора фосфатидилхолина в качестве липидной мембраны. Оптимальным для оценки мембранотропности исследуемых соединений был выбран интервал в 16 часов. Для изучения влияния заместителей на мембранотропность 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов определяли концентрацию исследуемых веществ в растворах за мембраной Са. На рисунке 2.16 представлены данные, полученные при использовании трех составов мембраны и концентрации начального раствора 1000 мкМ.
В лаборатории молекулярной фармакологии СПбГТИ(ТУ) разработана тест-система для анализа активности белков семейства р53. Конструкция на основе вектора pLV1 (рисунок 2.17) обеспечивает повышенную экспрессию зелёного флуоресцентного белка (EGFP) в клетках U2OS в ответ на увеличение активности р53 в клетке. Такая система позволяет определять интенсивность р53-опосредованного апоптоза по изменению флуоресценции клеток [147].
AmpR – ген устойчивости к ампицилину; HgR - ген устойчивости к гигромицину, EGFP – ген зелёного флуоресцентного белка EGFP; TATA-box – последовательность Голдберга-Хогнесса; EBNA-prot - ген белка ядерного антигена вируса Эпштейна–Барр; Ori-P site – ориджин-сайт репликации вируса Эпштейна – Барр; p53RE – фрагменты промотора CDKN1A, содержащие р53–регуляторный элемент. Наличие гена устойчивости к ампицилину позволяет амплифицировать плазмиду в культуре E.coli. Наличие гена устойчивости к гигромицину позволяет проводить селекцию клеток млекопитающих после трансфекции вектором pLV1. Наличие последовательности Голдберга–Хогнесса перед EGFP обеспечивает возможность синтеза EGFP в клетках млекопитающих, так как она необходима для процесса транскрипции. Наличие гена EBNA1 и сайта инициации репликации вируса Эпштейна–Барр позволяет конструкции реплицироваться в клетках млекопитающих.
Для валидации тест-системы использовали следующие соединения: а) доксорубцин – ингибитор топоизомеразы-II, провоцирующий экспрессию р53 в ответ на повреждение ДНК; б) нутлин-3а – известный ингибитор взаимодействия MDM2-р53, относящийся к классу цис-имидазолинов; в) соединения 4а–4c.
Для каждого вещества определяли диапазон концентраций, обработка которыми вызывает изменение доли светящихся клеток без значительного снижения их общего количества. Через 24 часа обработки реактиваторами р53 наблюдали явное изменение количества светящихся клеток по сравнению с контрольными клетками. Соединение 4b вызывало значительное снижение количества клеток (общий токсический эффект), что можно объяснить оксидативным стрессом, который имеет место при биотрансформации нитрогруппы [177].
Клетки обрабатывали 2,3-замещенными 3-гидроксиизоиндолинонами в течение 24 часов, в качестве контроля использовали нутлин-3а. По общему количеству р53+ и р53- клеток оценивали токсичность веществ. В таблице 2.5 представлены значения, полученные при обработке клеток веществами в концентрации 5 мкМ. Результаты для соединений с нитрогруппой не представлены, поскольку высокая токсичность веществ не позволила достоверно определить их активность.
Таблица 2.5 – Способность изоиндолинонов провоцировать р53-опосредованный апоптоз Вещество % EGFP клеток Количество р53+ клеток Количество р53-клеток Контроль ОД 8900 8600 Нутлин-3а 14 6100 8700 4а и 6300 8400 5а 3,8 5800 8000 6а 1,8 6000 8800 7а 4,0 5400 8700 14а 3,7 5000 8100 15а 5,8 4400 7900 16а 6,1 4300 7800 17а 5,7 4100 7700 18а 7,8 4000 8000 19а 8,1 4000 8300 4с 1,3 5400 7000 5с 3,2 4800 7600 6с 2,1 4900 8400 7с 4,1 4700 7700 14с 4,7 4300 7700 15с 7,0 3900 8000 16с 7,1 3700 8300 17с 10 3000 6900 18с 14 3200 7900 19с 15 3500 8000 - Относительная погрешность измерений не превышала 11%. Обработка сложными эфирами приводила к увеличению доли светящихся клеток по сравнению с немодифицированными соединениями 4 и 5, т.е. введение данных заместителей увеличивало способность 2,3-замещенных 3-гидроксиизоиндолинонов провоцировать р53-опосредованный апоптоз. В рамках каждого из рассмотренных рядов лучший результат показали сложные эфиры фенилглицина и валина. Экспрессия белка р53 в клетках при обработке производными аминокислот также была выше, чем при обработке немодифицированными соединениями (рисунок 2.19). Нутлин-3а 5с 18с ДМСО р53 в GAPDH Рисунок 2.19 - Уровень белка р53 в клетках НСТ-116 после 24-часовой обработки Аналогичные результаты были получены при проведении цитофлуорометрического теста на апоптоз по связыванию аннексина V: доля апоптотических клеток НСТ-116 после 24-часовой обработки (С = 10 мкМ) составила 31% в случае нутлина-3а и 18с и 33% в случае 19с, при этом веществу 5с соответствовало всего 2% апоптотических клеток (рисунок 2.20).
Оценка биологической активности веществ
Для оценки мембранотропности соединений использовали установку, состоящую из двух 96-луночных планшетов и крышки: вкладыш, образованный донорным отсеком с полупроницаемой мембраной в качестве донышек лунок (МultiScreen IP 0.45 мкм мil.МAIPNТR10, Мillipore), помещали в акцепторный отсек (МultiScreen мil.МAТRNPS50, Мillipore). Исследуемые вещества растворяли в фосфатном буфере (рН=7,4), содержащем 5% ДМСО. На донышки лунок донорного отсека наносили по 5 мкл раствора фосфолипидов в додекане, в лунки акцепторного отсека вносили фосфатный буфер, содержащий 5% ДМСО. Затем в лунки донорного отсека вносили растворы исследуемых веществ, и собирали установку. Конструкцию на 16 часов помещали в термостат при 37С и постоянном перемешивании (частота шейкера – 60 об/мин). Далее измеряли оптическую плотность растворов в акцепторных лунках с помощью спектрофотометра (UV-1800, Shiмadzu). В качестве контрольных соединений использовали кофеин и фуросемид.
Концентрации веществ в лунках акцепторного отсека (Са) рассчитывали, используя предварительно полученные количественные зависимости оптической плотности растворов от концентрации. Величину logPe, отражающую мембранотропность соединений, определяли по формуле (1) [ ( )], (1) где Vд – объем донорного отсека, см3; Vа – объем акцепторного отсека, см3; S – площадь поверхность мембраны, см2; Т – время инкубации, с; Cа – концентрация вещества в акцепторном отсеке, мг/мл; C – равновесная концентрация вещества в суммарном объеме отсеков, мг/мл. 126 3.5. Оценка биологической активности веществ 3.5.1. Использованные клеточные линии U2OS p53WT – клетки остеосаркомы человека, экспрессирующие белок р53 дикого типа. U2OS p53KO – клетки остеосаркомы человека с нокаутом гена р53. U2OS-pLV1-p21: вектор pLV1-p21 содержит ген зелёного флуоресцентного белка (EGFP) под контролем минимального промотора гена CDKN1A, содержащего сайт связывания для транскрипционного фактора р53. Связывание белков семейства р53 с последовательностью такого регуляторного элемента в составе промотора приводит к изменению уровня флуоресценции белка EGFP. HCT-116 p53WT – клетки карциномы кишечника человека, экспрессирующие белок р53 дикого типа. HCT-116 p53KD – клетки карциномы кишечника человека с нокдауном гена р53. 3.5.2. Подготовка клеточных культур и исследуемых веществ Приготовление растворов веществ: исследуемые вещества растворяли в ДМСО в концентрации 2000 мкМ, далее полученный раствор разбавляли ДМСО до концентраций 200 мкМ и 600 мкМ. При внесении таких растворов в питательную среду с клетками получали конечные концентрации веществ 1, 3 и 10 мкМ в среде с 0,5% ДМСО.
Культивирование клеток: для проведения экспериментов клеточные культуры культивировали в течение суток при 37оС в атмосфере 5% СО2 в среде DMEM (Биолот) с 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), 150 мг сухого L-глютамина (Биолот), пенициллином 50000 ед/фл и стрептомицином 50 мг/фл (Биолот) на 500 мл среды.
Способность веществ провоцировать апоптоз раковых клеток изучали с использованием клеточной линии U2OS-pLV1-p21 [147].
Клетки культивировали в 96-луночных планшетах как описано в разделе 3.5.2 (посев 10000 клеток на лунку). На следующий день проводили замену питательной среды на OptiMEM с исследуемыми веществами. В случае производных изоиндолинона и 3-иминоиндолинона в качестве контроля использовали растворы нутлина-3а в тех же концентрациях, что и исследуемые вещества (1, 3, 10 мкМ). Через 24 часа (или 16 часов в случае производных 3-иминоиндолинона) клетки обрабатывали в течение 10 минут в темноте красителем, который получали путем разведения Hoechst 33342 (Life Technologies) в ДМСО до концентрации 10 мг/мл и далее PBS до концентрации 4 мкг/мл. Далее клетки дважды отмывали PBS. Все эксперименты проводили в трех повторностях.
Подсчет количества клеток и уровня флуоресценции EGFP проводили с использованием имиджинговой системы Operetta (Perkin Elmer) с программным обеспечением Harmony 3.1. В каждой лунке планшета проводилась съемка нескольких полей на двух каналах: - канал «Hoechst 33342» (длины волн возбуждения 460–490 нм, длины волн излучения 500–550 нм) использовался для идентификации индивидуальных клеток; - канал «EGFP» (длины волн возбуждения 360–400 нм, длины волн излучения 410–480 нм) использовался для идентификации клеток с интенсивным зеленым свечением. Результат получали в виде общего количества клеток в поле и доли клеток с зеленым свечением (%).
Клетки U2OS и HCT116 обрабатывали исследуемыми веществами и нутлин-3а в качестве контроля в концентрации 10 мкМ. Через 24 часа клетки лизировали RIPA-буфером и проводили вестерн-блотт, используя антитела к р53 и MDM2; контроль – GAPDH. Клетки HCT119 обрабатывали исследуемыми веществами и нутлин-3а в качестве контроля в концентрации 10 мкМ. Далее клетки, суспендированные в связывающем буфере, смешивали с флуоресцеин-конъюгированным аннексином V (TermoFisher Scientific) и инкубировали в течение 10 мин. Для подсчета числа апоптотических клеток, которые связываются с аннексином V, использовали проточный цитометр (Guava easyCyte Flow Cytometer, Merck Millipore).