Введение к работе
Актуальность проблемы. Углеродные нанотрубки (carbon nanotubes, CNT) и конструкции на их основе в настоящее время находят широкое применение в различных областях нанотехнологии, в том числе, бионанотехнологии и наномедицины. Интерес к этому классу наноматериалов обусловлен их уникальными структурными, механическими и электронными свойствами, совместимостью с биомакромолекулами и клетками, а также наличием широкого спектра приемов ковалентной или нековалентной модификации. Важным свойством углеродных нанотрубок, открывающим возможность их биологического применения, является поглощение нанотрубок животными и растительными клетками. Другая особенность углеродных нанотрубок, а именно, высокая электрическая проводимость, в сочетании с их совместимостью с биомакромолекулами, дает возможность конструирования сенсорных систем для детекции широкого спектра мишеней: от малых молекул до протяженных нуклеиновых кислот (НК), белков и живых клеток.
Несмотря на определенную химическую инертность углеродных нанотрубок,
они могут быть модифицированы путем введения на их поверхность
функциональных групп, что позволяет изменять свойства нанотрубок, расширяя
возможности их использования. Для введения функциональных групп на
поверхность одностенных и многостенных углеродных нанотрубок разработан
ряд методов ковалентной и нековалентной модификации поверхности и концов
нанотрубок, среди которых следует выделить методы нековалентной
функционализации нанотрубок полициклическими ароматическими
соединениями, выступающими в качестве якорных групп для иммобилизации биологических молекул на поверхности CNT. Комбинация ковалентных и нековалентных методов функционализации CNT позволяет получать наноконструкции, содержащие одновременно несколько различных функциональных групп.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлись разработка подхода к созданию новых
мультифункциональных наноконструкции, представляющих собой
нековалентные гибриды пирен-содержащих олигонуклеотидов и НК-комплексов с модифицированными углеродными нанотрубками, и демонстрация потенциальной возможности использования созданных конструкций как транспортеров НК в клетки и компонентов электрохимических биосенсоров. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать методы создания мультифункциональных гибридов одностенных и многостенных CNT с пиренильными конъюгатами олигонуклеотидов;
разработать методы сборки гибридов модифицированных одностенных углеродных нанотрубок с НК-дуплексами и трехкомпонентными НК-комплексами;
изучить физико-химические свойства полученных мультифункциональных гибридов одностенных углеродных нанотрубок с пиренсодержащими олигонуклеотидами и НК-комплексами, исследовать их биосовместимость и возможность проникновения в клетку;
изучить возможность использования электродов на основе гибридов вертикально ориентированных многостенных углеродных нанотрубок с пиренильными конъюгатами олигонуклеотидов для детекции РНК-мишеней.
Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен новый подход к получению мультифункциональных гибридов одностенных и многостенных углеродных нанотрубок с нуклеиновыми кислотами, основанный на сочетании процессов ковалентной модификации концов нанотрубок органическими функциональными группами и нековалентной иммобилизации олигонуклеотидов и их комплексов на поверхности нанотрубок с использованием остатков пирена, введенных в 5'-положение олигонуклеотидов. Разработаны новые методы оценки эффективности формирования гибридов пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов с модифицированными одностенными углеродными нанотрубками. Показано, что основной вклад в эффективность адсорбции пиренильных конъюгатов олигонуклеотидов на поверхности одностенных углеродных нанотрубок вносит тип химической модификации нанотрубок, а также длина олигонуклеотида. Предложена стратегия создания гибридов siPHK-содержащих конструкций с модифицированными одностенными углеродными нанотрубками и продемонстрировано высвобождение siPHK из состава гибрида под действием РНКазы Н. Показана низкая цитотоксичность созданных гибридных конструкций на основе модифицированных одностенных углеродных нанотрубок в широком диапазоне концентраций, продемонстрировано их проникновение через клеточную мембрану путем эндоцитоза. Показана принципиальная возможность детекции РНК-мишени за счет изменения емкостных характеристик гибридного электрода из вертикально ориентированных многостенных углеродных нанотрубок, содержащих олигорибонуклеотид-зонд или его пиренильный конъюгат.
Настоящая работа вносит вклад в изучение взаимодействий олигонуклеотидов и НК-комплексов с одностенными и многостенными
углеродными нанотрубками. Можно ожидать, что предложенный в работе подход позволит создать перспективные мультифункциональные транспортеры терапевтических нуклеиновых кислот в клетки и высокочувствительные электрохимические сенсоры нуклеиновых кислот.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией, глава в монографии и получен патент РФ. Результаты работы представлены на Втором Международном форуме по нанотехнологиям RusNanoTech'09 (Москва, 2009), III Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010), Второй Международной конференции по функциональным, гибридным и наноматериалам (Страсбург, Франция, 2011), Ежегодной конференции по углеродным материалам (Краков, Польша, 2012), Международной конференции «Постгеномные технологии для биомедицины» (Новосибирск, 2012), Международной летней школе «Нанотехнология: от фундаментальных исследований к инновациям» (Буковель, Украина, 2012) и др.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 197 страницах, содержит 75 рисунков, 7 схем и 13 таблиц. Библиография включает 438 литературных источников.