Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярное узнавание является одной з наиболее важных проблем биоорганической химии, существенной ля понимания многих биологических процессов. Среди разнообраз-ых систем молекулярно-биологического узнавания особая роль при-адлежит белково-нуклеиновому узнаванию. Этот процесс осуществля-тся при образовании специфических комплексов белков с нуклеино-ыми кислотами (НК). Такие комплексы образуются на всех этапах еализации генетической информации: при репликации и репарации ;НК, биосинтезе РНК и белка, регуляции активности генов. В этих роцессах происходит передача информации от НК к белкам, однако :х физико-химическая природа остается невыясненной. Одной из ак- уальных задач является выяснение кода белково-нуклеинового узна-ания - закономерностей стереохимического пространственного соот-етствия фрагментов структуры белка и НК. Детальное понимание фи-ико-химических механизмов белково-нуклеинового узнавания явля-ітся чрезвычайно трудной задачей даже в наиболее простых случаях. [оэтому исследование простых модельных систем взаимодействия на юномер-мономерном и мономер-полимерном уровне, позволяющее вы-:ленить и оценить роль и специфичность отдельных относительно ілементарньїх взаимодействий, является актуальной задачей для по-іимания сложных явлений белково-нуклеинового узнавания.
В нашей работе исследование узнавания проведено на простях- мо-[елях - системах комплексообраэоэания между компонентами белков і НК. Основной задачей в этих исследованиях было выяснение роли одородных связей (Н-связей) как наиболее избирательных взаимо-іействиях, вносящих определяющий вклад в процесс узнавания, [зучен новый класс относительно слабых Н-связей типа С-Н-»-0, которые должны играть важную роль в молекулярном узнавании. Экспе-шментально исследованы в растворах С-Н-->0 связи, образуемые :8-Н группами пуриновых и С6-Н группами пиримидиновых оснований [К и получены термодинамические характеристики комплексов с таки-ш связями.
Среди относительно простых систем белково-нуклеинового узнава-іия осрбое место занимает фермент-нуклеотидное узнавание при био-:интезе НК. Это узнавание непосредственным образом связано с та-:ими важными биологическими процессами как мутагенез, надежность іункционирования генома, с процессами, происходящими при вирус-!ых и бактериальных инфекциях, с канцерогенезом и старением. В ітом плане весьма актуальной является разработка концепции фер-
мент-нуклеотидного узнавания инвариантных атомов и групп в соста ве комплементарной нуклеотидной пары при биосинтезе НК. Согласно этой концепции правильность выбора нуклеотида при биосинтезе НК обеспечивается не только полинуклеотидной матрицей, но и узнава нием ферментом правильной нуклеотидной пары. Предполагается нали чиє у ферментов биосинтеза НК наряду с хорошо известными в энзи-мологии каталитически (активным) и регуляторным (аллостерическим центрами дополнительно узнающего центра. Механизм фермент-нуклео тидного узнавания, согласно предложенной концепции, осуществляет' ся путем образования специфических Н-связей между атомами и груп' пами узнающего центра полимераэ и инвариантными атомами и группами в комплементарных парах нуклеотидов в фермент-матрица-субстратном комплексе. При этом узнающий центр фермента играет роль дополнительной матрицы, определяющей правильность синтеза.
Цель работы состояла в том, чтобы на основе анализа простых модельных систем молекулярного узнавания и экспериментального исследования взаимодействий между компонентами белков и НК выявить принципы и закономерности, лежащие в основе белково-нуклеинового узнавания. В том числе, выявить.физико-химические основы фермент--нуклеотидного узнавания при биосинтезе НК, обеспечивающие высокую точность и надежность передачи генетической информации.
На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:
-
Рассмотрение основных возможных схем образования Н-связей между боковыми радикалами аминокислот и основаниями НК и экспериментальное подтверждение существования таких связей между карбоксильной, амидной, гуанидиновой и аминогруппами аминокислот и азотистыми основаниями НК на мономерном уровне и при взаимодействии аминокислот с ДНК.
-
Обнаружение и исследование методом ЯМР слабых Н-связей типа С-Н---0 в растворах метилированных аналогов оснований НК. Получение термодинамических характеристик таких связей для С8-Н групп пуринових и С6-Н пиримидйновых оснований.
-
Создание и обоснование концепции фермент-нуклеотидного узнавания по инвариантным N3 атомам и С8-Н группам пуриновых и 02 атомам и С6-Н группам пиримидйновых оснований в комплементарных парах нуклеотидов при биосинтезе НК, как фундаментального фактора, определяющего высокую точность и надежность передачи генетической информации. Формулировка принципа стереохимического усиления специфичности в молекулярно-биологических системах узнавания.
-
Результаты экспериментальной проверки некоторых следствий
энцепции фермент-нуклеотидного узнавания в РНК-полимеразной си-геме с помощью 8-бром и 8-окси замещенных аналогов АТР и GTP. зспособность этих аналогов к замещению природных субстратов при нициации синтеза РНК, как свидетельство узнавания С8-Н группы уриновых нуклеотидов в этом процессе. Неоднозначные субстратно-кодовые свойства 8-окси-СТР,как проявление узнавания РНК-полиме-азсй инвариантных N3 атомов пуринов и 02 пиримидинов в компле-ентарных парах оснований НК.
Научная новизна. Все перечисленные выше результаты получены втором впервые. Ряд данных по взаимодействию между компонентами елков и НК были подтверждены и развиты в исследованиях зарубеж-ых авторов. Однако, приоритет наших исследований признан и полу-енные нами результаты цитируются в обзорах (Helene, Maurizot, 981; Helene, Lancelot, 1982) и монографии (Зенгер, 1987) . Впер-ые получены доказательства существования С-Н---0 Н-связей в ра-творах и определены их термодинамические характеристики. Энталь-ия таких связей лишь в 1.5-2 раза меньше, чем для обычных Н-свя-ей между атомами кислорода и азота. Следовательно, такой тип' вязей должен учитываться при изучении внутри- и межмолекулярных заимодействий НК и их компонентов и при биологическом функциони-овании НК и нуклеотидов. Впервые разработана концепция фермент-уклеотидного узнавания инвариантных атомов и групп в комплемен-арных парах нуклеотидов при биосинтезе НК. Такими инвариантными вляются N3 атомы и С8-Н группы пуриновых и 02 атомы и С6-Н груп-ы пиримидиновых оснований, а также состав и конформационные осо-енности сахаро-фосфатной части нуклеотида. Это узнавание являет-я одним из механизмов, обеспечивающих высокую точность и надеж-ость воспроизведения генетической информации. Впервые дана фор-іулировка принципа стереохимического усиления специфичности и по-азана возможность компенсации ошибок за счет неспецифических !заимодействий. Впервые показано, что 8-бром-АТР, 8-окси-АТР, -бром-GTP, 8-okch-GTP не способны к инициации синтеза олиго- и юлинуклеотидов в РНК-полимеразной реакции. В реакции синтеза по-іинуклеотида на матрице поли [(clA-T) (dA*Tj) РНК-полимеразной E.ooli гаказано, что в-окси-GTP узнается и проявляет субстратные свойст-ia UTP. А при абортивном синтезе олигонуклеотидов на промоторе Л. ДНК мутанта фага Т7 ЛД111 в-окси-GTP проявляет субстратные :войства как GTP, так и UTP. Эти факты впервые показывают прояв-іение этим аналогом неоднозначных субстратно-кодовых свойств.
Практическая ценность работы. Концепция Фермент-нуклеотидного гзнавания предсказывает ряд новых явлений, доступных эксперимен-
тальнов проверке, В этом плане она является стимулом для дальней ших экспериментальных исследований. Она вносит дополнительный вклад в понимание процессов точечного мутагенеза. Из нее следует что мутагенными могут быть не только воздействия, изменяющие структуру ДНК, но также узнающий центр фермента и, более того, воздействия, влияющие на характер взаимодействий в комплексе ДНК -фермент-нуклеозидтрифосфат. Эта концепция открывает возможность для целенаправленного поиска новых биологически активных веществ влияющих на функцию узнавания. Она может быть использована для конструирования лекарственных средств: противовирусных, антибактериальных и противоопухолевых препаратов. Выяснение роли 8-ок-си-АТР и в-окси-GTP в РНК-полимеразной реакции представляет прак тический интерес, т.к. соответствующие производные образуются в клетках под действием ионизирующей радиации (Hutchinson, 1985) . Модификация гуанина в 8-окси-гуанин осуществляется в нуклеозидах и ДНК под влиянием кислородных радикалов, в том числе, ряда канцерогенных веществ (Kasai eb al., 1987). Его биологическая роль, обусловленная проявлением неоднозначных субстратно-кодовых свойств, может оказаться существенной для понимания некоторых путей спонтанного, радиационного и химического мутагенеза и канцерогенеза. Данные о характере взаимодействий между компонентами белков и НК могут быть использованы для построения молекулярных моделей белково-нуклеиновых комплексов.
Апробация работы и публикации. Материалы работы докладывались и обсуждались на Всесоюзных симпозиумах по межмолекулярным взаимодействиям молекул (3 симпозиум - Пущино, 1976; 4 симпозиум -Баку, 1978; 5 симпозиум - Алма-Ата, 1980) на 3 и 5 Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1977, 1984), на 4 и б двусторонних Советско-Французских симпозиумах по взаимодействию белков и нуклеиновых кислот (Ташкент, 1977; Цхалтубо, 1982) , на 2 координационном совещании "Системы надежности клеток" (Канев, 1977), на 5 Советско-американском симпозиуме "Критерии необходимых и достаточных тест-систем для идентификации потенциальных мутагенных и канцерогенных факторов в окружающей среде" (Пущино-Баку, 1978), на симпозиумах стран СЭВ по биофизике нуклеиновых кислот (Брно, ЧССР, 1977; Таллин, 1981; Сегед, ВНР, 1983), на 4 Всесоюзном совещании по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1977), на 4 Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1977), на Всесоюзном совещании "Надежность Функционирования процессов репарации ДНК" (Пущино, 1980), на 8 йенском симпозиуме по биофизической химии "Узнавание между биопо-
пимерами" (Веймар, ГДР, 1980), на Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига, 1982), на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982) , на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы репликации, репарации и рекомбинации в норме и при действии радиации у эукариот" (Пущино, 1983), на 6 Всесоюзном симпозиуме "Конформаци-онные изменения биополимеров в растворах" (Тбилиси, 1985), на 2 Всесоюзном рабочем совещании "Энзимология матричных синтезов нуклеиновых кислот" (Новосибирск, 1986), а также на научных конференциях Института биологической физики АН СССР в 1978, 1980, 1983, 1984 и 1985 гг.