Содержание к диссертации
Введение
2. Химический состав и биологическая активность экстрактов растений рода Rhododendron (обзор литературы) 9
2.1. Введение 9
2.2. Неполярные компоненты рододендронов 10
2.2.1. Эфирные масла 10
2.2.2. Алканы, алифатические спирты, жирные кислоты 12
2.3. Изопреноиды растений рода Rhododendron 13
2.3.1. Дитерпеноиды рододендронов 13
2.3.2. Тритерпеноиды рододендронов 16
2.4. Ароматические соединения рода Rhododendron 17
2.4.1. Фенолы, фенолокислоты и другие производные бензола 17
2.4.2. Кумарины 20
2.4.3. Флавоноиды 21
2.5. Биологическая активность некоторых суммарных экстрактов и вторичных метаболитов рододендронов 26
3. Исследование качественного и количественного химического состава Rhododendron adamsii Render (обсуждение результатов) 30
3.1. Подготовка и экстракция сырья 30
3.2. Сравнительный анализ химического состава эфирных масел листьев и стеблей Rhododendron adamsii Render, Rhododendron aureum Georgi и Rhododendron dauricum L 43
3.3. Качественный состав и количественное содержание жирных кислот в листьях и стеблях рододендрона Адамса 49
3.4. Количественное определение урсоловой и олеаноловой кислот в некоторых представителях семейства Ericaceae 55
3.5. Другие вторичные метаболиты рододендрона Адамса 60
3.5.1. Количественное содержание основных флавоноидов листьев и стеблей Rhododendron adamsii 60
3.5.2. Мио-инозитол и ацетамид в листьях Rh. adamsii 70
3.6. Некоторые пренилированные производные фенолов, выделенные из листьев рододендрона Адамса Rhododendron adamsii Rehder 71
4. Фармакологические испытания некторорых ввеществ, выделенных из рододендрона Адамса 83
4.1. Исследование фармакологической активности метилового эфира каннабигерорциновой кислоты 83
4.2. Коагулометрическое исследование на фоне введения метилового эфира КГК и нового соединения 86
4.3. Изучение гипотермического действия нового соединения и его смеси с метиловым эфиром КГК 88
5. Экспериментальная часть 89
5.1. Разработка экстракционной методики 90
5.2. Выделение и анализ эфирных масел 90
5.2.1. Растительный материал и процедура выделения масла 90
5.2.2. Процедура анализа масла 91
5.3. Количественное определение жирных кислот 92
5.3.1. Растительное сырье и процедура выделения ЖК 92
5.3.2. Анализ жирных кислот методом ГЖХ и ГХ/МС 94
5.4. Определение содержания урсоловой и олеаноловой кислот 95
5.4.1. Растительный материал и процедура выделения 95
5.4.2. Хроматографические анализы методом ВЭЖХ, ГЖХ и ГХ/МС... 95
5.5. Выделение мио-инозитола и ацетамида 96
5.6. Выделение и идентификация флавоноидов 97
5.6.1. Стандартные образцы и хроматографические анализы 97
5.6.2. Определение приведенной весовой экстинкции стандартных образцов 97
5.6.3. Содержание нативных флавоноидов в сырье 98
5.6.4. Определение суммы флавоноидов после гидролиза 98
5.6.5. Анализ углеводов методом ВЭЖХ 99
5.7. Выделение пренилированных фенолов из листьев Rh. adamsii и их химическая модификация 99
5.7.1. Выделение метилового эфира (Е)-3-(3,7-диметилокта-2,6-диенил)-2,4-дигидрокси-6-метилбензойной (каннабигерорциновой) кислоты 99
5.7.2. Получение диацетата метилового эфира каннабигерорциновой кислоты 100
5.7.3. Получение дибензоата метилового эфира каннабигерорциновой кислоты 101
5.7.4. Выделение даурихроменовой кислоты 102
5.7.5. Выделение 1 -(3-метилбутаноил)-1 а,4а,7-триметил-1,1 а, 1 а1,2,3,4,4а, 9Ь-октагидроциклобута[к1]ксантен-9-ола 102
5.7.6. Получение 9-(2-(4-бромфенил)-2-оксоэтокси)-1 -(3-метилбутаноил)- 1 а,4а,7-триметил-1,1 аД а1,2,3,4,4а,9Ь-октагидроциклобута[к1] ксантена 103
5.7.7. Получение 6,8-дибром-1-(3-метилбутаноил)-1а,4а,7-триметил-1Да, 1 а1,2,3,4,4а,9Ь-октагидроциклобута[к1]ксантен-9-ола 104
5.7.8. Получение 6,8-дибром-1-(3-метилбутаноил)-9-(2-(4-бромфенил)-2-оксоэтокси)-1а,4а,7-триметил-1Да,1а1,2,3,4,4а,9Ь-октагидроцикло-бута[к1]ксантена 105
5.7.9. Получение 1а,4а,7-триметил-1-(3-метилбутаноил)-1Да,\ах ^l^J^J^a, 9Ь-октагидроциклобута[к1]ксантен-9-илбензоата 106
6. Выводы 108
7. Список литературы 110
- Биологическая активность некоторых суммарных экстрактов и вторичных метаболитов рододендронов
- Качественный состав и количественное содержание жирных кислот в листьях и стеблях рододендрона Адамса
- Коагулометрическое исследование на фоне введения метилового эфира КГК и нового соединения
- Выделение метилового эфира (Е)-3-(3,7-диметилокта-2,6-диенил)-2,4-дигидрокси-6-метилбензойной (каннабигерорциновой) кислоты
Введение к работе
В настоящее время в мире происходит постоянное расширение арсенала лекарственных препаратов за счет внедрения в медицинскую практику новых агентов растительного происхождения. Это обусловлено доступностью и возобновляемостью используемого сырья, многообразием продуцируемых метаболитов, широким спектром их действия. При этом зачастую препараты природного происхождения обладают большей активностью и меньшей токсичностью, чем их синтетические аналоги, что оказывается незаменимым при лечении хронических заболеваний. Исследование природных метаболитов, в частности, веществ растительного и микробиального происхождения — одна из важнейших областей медицинской химии, а если судить по числу и регулярности присуждения нобелевских премий в области химии, то эта область исследований стала в XX столетии весьма престижной.
Мощнейшим источником природных биологически активных соединений является растительное сырье. Вещества растительного происхождения используются во многих сферах жизнедеятельности человека и, в частности, в здравоохранении. Биологические активные композиции и добавки, приготовленные на основе растительного сырья, широко применяются для общего укрепления здоровья населения, профилактики преждевременного старения организма человека, повышения его сопротивляемости различным неблагоприятным природным и антропогенным факторам. Все большее внимание уделяется таким проблемам, как поиск и разработка лекарственных препаратов для лечения сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, ВИЧ, гепатита, гиперхолестеринемии, и в этой области некоторые отечественные разработки достигли значительных успехов.
В настоящее время в Российской Федерации более 95% лекарственных субстанций являются предметом импорта, в связи с чем назрела острая необходимость создания и производства отечественных лекарственных препаратов. Поиск новых природных источников, в частности, растений, произрастающих на территории нашего государства, исследование их качественного и количественного состава, препаративная наработка основных растительных метаболитов для фармакологических исследований и последующих химических трансформаций является актуальной задачей. При этом, несмотря на то, что количество лекарственных растений очень велико, только незначительная их часть была подвергнута современному фотохимическому анализу.
Практически все биологически активные экстракты растений — многокомпонентные смеси. Основной целью фитохимических исследований является идентификация максимально возможного количества веществ, содержащихся в экстрактивных смесях, а также разработка способов их выделения в индивидуальном состоянии. Ввиду близости их по химическим и физическим свойствам эта задача является весьма сложной и часто требует дорогостоящего оборудования и материалов.
Объектом нашего исследования является рододендрон Адамса Rhododendron adamsii Render, широко применяемый в тибетской и монгольской медицинах. Бурятское население применяет это растение в качестве стимулирующего и тонизирующего средства, при сердечных заболеваниях, отеках сердечного происхождения, в качестве мочегонного, при простудных заболеваниях. Среди биологически активных веществ надземной части этого растения были обнаружены дубильные вещества, кумарины, флавоноиды, эфирное масло, урсоловая и олеаноловая кислоты, простые фенольные соединения, а первые фармакологические испытания некоторых экстрактов этого растения, выполненные еще в 50-х гг. прошлого века, показали перспективность работ по его фитохимическому изучению. Следует заметить, что основные работы по изучению состава рододендрона Адамса были выполнены в 60-70-х гг. прошлого столетия, когда приборная база, использовавшаяся в исследованиях, была недостаточно мощной.
Представленная работа посвящена исследованию качественного и количественного состава листьев и стеблей Rh. adamsii. В ее рамках была представлена последовательность растворителей, позволяющая упростить составы получаемых экстрактов.
В результате настоящей работы изучен компонентный состав полярных и липофильных экстрактов Rh. adamsii. Подробно исследован химический состав и идентифицированы основные компоненты эфирных масел листьев и стеблей данного растения, а также проведен сравнительный анализ с составом эфирным масел родственных ему рододендронов.
В листьях и стеблях рододендрона Адамса впервые установлен состав свободных и связанных жирных кислот и определено их содержание. Наряду с жирными кислотами, определено количественное содержание таких важных метаболитов как урсоловая и олеаноловая кислоты.
Из полярных экстрактов листьев и стеблей рододендрона Адамса получены и охарактеризованы 4 флавоноида, являющимися мажорными для данного растения (мирицетин, кверцетин, дигидрокверцетин и рутин), а также впервые определено их массовое содержание. Рутин и дигидрокверцетин из Rh. adamsii были выделены впервые. Также были выделены и охарактеризованы мио-инозитол и ацетамид.
Впервые из листьев Rhododendron adamsii Rehder выделены три соединения, принадлежащие классу пренилированных фенолов: даурихроменовая кислота, метиловый эфир каннабигерорциновой кислоты, а также новое, ранее не описанное соединение циклобутаоктагидроксантенового типа. Метиловый эфир каннабигерорциновой кислоты является новым природным соединением. Исследовано гидрирование, бромирование, бензоилирование и ацилирование метилового эфира каннабигерорциновой кислоты, а также бромирование и бензоилирование 1-(3-метилбутаноил)-1а,4а,7-триметил-1,1а,1а1,2,3,4,4а,9Ь-октагидроциклобута[к1]ксантен-9-ола, в результате чего были получены новые вещества, для которых планируется провести фармакологические исследования. Результаты выполненной работы обсуждались на всероссийских и международных конференциях («Химия и технология растительного сырья», г. Сыктывкар и г. Уфа; «Новые достижения в химии и технологии растительного сырья», г. Барнаул; «Современные проблемы органической химии», г. Новосибирск; «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений», Алма-Ата.).
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ЛФМИ к.х.н. Корчагиной Д. В. и д.х.н. Гатилову Ю. В. за помощь в установлении структур выделенных соединений, сотруднику ЛЛиПБАС к.х.н. Фоменко В. В., сделавшему много ценных предложений к работе, зав. ЛФИ НИОХ СО РАН д.б.н. Толстиковой Т. Г. и сотрудникам лаборатории за проведенные биологические испытания выделенных соединений, сотрудникам ЛЭИХА НИОХ и лично Морозову С. В. за выполнение газохроматографических анализов и обсуждение полученных результатов. Отдельно автор благодарит ведущего инженера ЛЛиПБАС Комарову Н. И., внесшую неоценимый вклад в работу, за выполнение хроматографических анализов и постоянную поддержку. Также автор благодарит научного руководителя д.х.н. Салахутдинова Н. Ф. за проявленное терпение и внимательное отношение.
Биологическая активность некоторых суммарных экстрактов и вторичных метаболитов рододендронов
К сожалению, в упомянутом выше обзоре [15] приведена информация только для 5 из 16 растений рода рододендрон, произрастающих на территории бывшего СССР [16]: Rh. dauricum, Rh. luteum, Rh. mucronulatum, Rh. ponticum и Rh. schlippenbachii. В данном разделе мы попытаемся проанализировать данные по флавоноидам рододендронов, не вошедшие в работы [14] и [15].
Суммарное содержание флавоноидов и кумаринов в 11 рододендронах было определено Белоусовым и сотрудниками [60] (табл. 5). Из цветков белой азалии (Rh. mucronulatum) Вада выделил флавоноль-ный гликозид, после гидролиза которого была обнаружена рамноза и новый флавонол [62]. Структура полученного флавонола была установлена как 5-метиловый эфир кверцетина, а гликозид идентифицировали как 3-рамнозид. Для агликона и его рамнозида были предложены названия «азалеатин» и «азалеин» соответственно (табл. 6).
Методом двумерной бумажной хроматографии изучен химический состав полифенольного комплекса рододендрона Адамса [50]. Показано наличие 9 флавоноидов (3 агликона и 6 гликозидов, табл. 7). Впервые было установлено, что в растении содержатся флавоноиды кверцетин, мирицетин и азалеатин, причем преобладающим компонентом является кверцетин. Из гликозидов были идентифицированы авикулярин, гиперозид и мирицитрин.
Авторы работы [50] утверждают, что качественный состав флавоноидов листьев и стеблей Rh. adamsii практически не различается, за исключением ми-рицитрина (в листьях — следовое содержание), а максимальное содержание флавоноидов приходится на фазу цветения. В надземной части рододендрона Адамса методом дифференциальной спектрофотометрии было определено суммарное содержание флавоноидов в пересчете на кверцетин [63]. Показано, что суммарное содержание веществ в сырье, собранном в разных пунктах респ. Бурятии в фазе цветения, варьируется от 2.0 до 3.0 % по массе, что хорошо согласуется с данными, полученными ранее [60]. Авторы [63] полагают, что оптимальными условиями извлечения флавоноидов из растительного сырья является экстракция 90%-м этанолом с добавлением 1% (по массе) соляной кислоты. , Из листьев рододендрона кавказского Rh. caucasicum хроматографией на полиамиде выделены кверцетин-З-Б-галактозид и кверцетин-3-L арабинозид [64, 65]. Соединения были идентифицированы по температурам плавления, УФ спектрам и продуктам гидролиза. По данным работы [64], распределение флавоноидов в органах Rh. caucasicum неравномерно, больше всего их содержится в вегетативных почках и листьях, а минимальное содер жание наблюдается в стеблях растения [66]. , В листьях рододендрона даурского Rh. dauricum были найдены гиперо-зид, авикулярин, азалеатин и кверцетин [59, 67]. Соединения были идентифицированы по УФ спектрам и продуктам кислотного HJ ферментативного расщепления. Позже методом капиллярного электрофореза с электрохимической детекцией в этом растении было определено содержание кверцетина (51 мкг/г сырья) и дигидрофлавона фаррерола (148 мкг/г) [52]. Из листьев и цветков Rh. ferrugineum выделены и идентифицированы методами спектроскопии и 13С, а также ВЭЖХ/МС 6 известных фла воноидов: гиперозид, мирицетин 3-О-галактопиранозид, кемпферол 3-0-(6"-0-ацетил)-глюкозид, кверцетин 3-0-(6"-0-ацетил)-галактозид, кверцетин 3-О(3",6"-0-диацетил)-галактозид и два новых дигидрофлавоновых гликозида: транс-таксифолин З-О-арабинопиранозид и цис-таксифолин З-О-арабино пиранозид [68]. Шварцман, изучая химический состав рододендрона желтого Rh. lueum, выделил флавоновый глюкозид кверцетин-3-глюкозид (изокверцитрин) [69]. Другими исследователями в листьях этого растения были найдены авикулярин, гиперозид, мирицетин, мирицитрин, мирицетин-З-О-Ь-рамнозид, кверцетин, кемпферол, и азалеатин [49, 65]. Досс и сотрудники [70] из листьев Rh. cv. Cynthia (гибрид Rh. cataw-biense и Rh. griffithianurn) выделили фракцию соединений, стимулирующую фагоцитоз листьев растения жуком-долгоносиком. Мажорным компонентом полярного экстракта, полученного из этой фракции (растворяющимся в этаноле), оказался кверцетин-3-галактозид. 26 было подтверждено наличие этого класса соединений в листьях Rh. adamsii [9], а в работе [66] было изучено содержание и количественные изменения суммы лейкоантоцианидов в листьях рододендрона кавказского (Rh. caucasicum) в зависимости от возраста растения и фазы вегетации. Авторы [66] показали, что лейкоантоцианиды составляют основную часть флавоно идных соединений, а больше всего их содержится в двухлетних листьях (около 200 мкг/кг).
Качественный состав и количественное содержание жирных кислот в листьях и стеблях рододендрона Адамса
Известно, что некоторые вторичные метаболиты растений могут накапливаться в отдельных частях растения (листья, стебли, почки, корни и т.д.). Мы считаем, что для корректного установления химического состава растения уже на этапе подготовки его к экстракции необходимо провести тщательную сортировку сырья, т.е. разделить между собой все части растения и проводить экстракцию каждой из них по отдельности. Возможна ситуация, когда после анализа экстрактов такая сортировка не потребуется. Это может произойти в том случае, когда разные части растения (листья, стебли, почки, корни и т.д.) будут близки по химическому составу, или действующее вещество, которое требуется выделить, равномерно распределено по всему растению, но на этапе первичного исследования растения эта процедура, на наш взгляд, является важной.
Следующим, обязательным, по нашему мнению, этапом должен стать подбор оптимального режима измельчения сырья. Эта процедура необходима, поскольку измельченное сырье имеет большую площадь контакта с рас-творителем-экстрагентом, вследствие чего извлечение становится более полным и требует меньше времени. В то же время, при попытке максимально мелкого перетирания сырья оно подвергается воздействию больших давлений, что может привести к протеканию механохимических реакций, например, окислению веществ кислородом воздуха. При тонком измельчении также могут произойти разрушения некоторых органелл клеток растения, в которых содержатся ферменты, отвечающие за трансформации растительных соединений. При высвобождении таких ферментов могут начаться химические реакции, что приведет к драматическому изменению химического состава растения.
Таким образом, уже на стадии подготовки растительного сырья к экстракции требуется соблюдать определенные условия при его сушке, сортировке и измельчению. Это должно способствовать ускорению процесса экстракции растительных соединений и, как следствие, одновременно позволить избежать возникновения артефактов.
Для осуществления максимально полной экстракции компонентов растительного сырья, по нашему мнению, необходимо выполнить некоторые условия. Мы считаем, что экстракцию следует проводить в аппарате Сокслета. Преимуществом использования именно непрерывного экстрактора является то, что экстракция всегда осуществляется чистым растворителем при его многократной циркуляции. В этом случае максимально полно проявляется селективность растворителя, заключающаяся в извлечении І даже малорастворимых в нем компонентов. При экстракции растительного сырья методом настаивания до постоянного веса велика вероятность того, что извлечение закончится преждевременно, либо потребуется большое количество растворителя, а процесс будет проходить в течение продолжительного времени.
Зачастую групповой анализ содержания некоторых классов органических соединений заключается в экстракции определенным растворителем и последующей обработке полученных суммарных экстрактов. К примеру, для определения жирнокислотного состава растений используют щелочной гидролиз гексанового экстракта с последующим метилированием реакционной смеси диазометаном [79] и дальнейшим анализом методом ГХ или ХМС. Известны также методики определения флавоноидов методом кислотного или щелочного гидролиза водно-спиртовых вытяжек растительного сырья.
Недостатком таких методик является способность растворителя извлекать несколько классов соединений, которые при дальнейшей обработке экстракта могут трансформироваться с образованием побочных продуктов, и в дальнейшем их обнаружение станет невозможным.
В связи с этим, мы полагаем, что при детальном исследовании химического состава неизвестного растительного сырья следует избегать любых химических модификаций суммарных экстрактов, по крайней мере, до этапа их разделения по классам соединений. По нашему мнению, такое разделение проще всего осуществляется с помощью распределения суммарного экстракта между несмешивающимися растворителями (дробная экстракция) или применения последовательной экстракции непосредственно растительного сырья серией растворителей в порядке увеличения их элюотропности и полярности. Последний подход позволит добиться уменьшения потерь вещества, возникающих при проведении дробной экстракции.
На следующем этапе проводится выделение индивидуальных растительных соединений. Здесь следует заметить, что самым распространенным вариантом разделения растительных компонентов является колоночная хроматография на силикагеле, окиси алюминия, полиамидных смолах и некоторых других прямофазных сорбентах. Подавляющее большинство работ, посвященных анализу природных соединений, основано именно на таком способе выделения широкого спектра классов веществ: флавоноидов [80], алкалоидов [81], сапонинов и др. В то же время, у прямофазного варианта разделения веществ имеется ряд недостатков, в некоторых случаях затрудняющих работу или делающих ее невозможной. Прежде всего, это Ібольшая длительность процессов уравновешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких растворителей с определенной и воспроизводимой влажностью. Из этого следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селективности. Существенные недостатки адсорбентов, особенно окиси алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединений, их разложения, необратимой сорбции, также общеизвестны.
При выделении индивидуальных веществ из полученных экстрактов следует пользоваться «щадящими» способами, основывающимися на распределении сырья между двумя жидкими фазами с последующим анализом их состава. В частности, можно проводить распределение компонентов суммарного экстракта между компонентами двухфазных систем бензол/водный ацетон, нефрас/метанол, петролейный эфир/80% этанол и др. Такая процедура упростит состав экстрактов и в некоторых случаях даже может привести к выделению соединения в чистом виде.
Коагулометрическое исследование на фоне введения метилового эфира КГК и нового соединения
Эфирные масла (ЭМ) — душистые, легко летучие вещества, содержащиеся в различных частях растений, главным образом в цветах, листьях, плодах, корнях. Из фармакологических свойств наиболее характерно для эфирных масел наличие противовоспалительной, антимикробной, противовирусной и противоглистной активности. Кроме того, некоторые эфирные масла оказывают выраженное влияние на деятельность сердечно-сосудистой системы и ЦНС, обладают транквилизирующими и успокаивающими свойствами. Эфирные масла применяются преимущественно для ароматизации пищевых продуктов, напитков, изделий бытовой химии, в фармацевтической промышленности, в медицине и ароматерапии, а также как растворители (скипидар). Ароматерапия подразумевает не только лечение ароматами, но их применение в соответствии с правилами фармакотерапии, так же, как применение других лекарственных средств.
В настоящее время известно более 2000 эфиромасличных растений. Содержание эфирных масел в растениях зависит от ряда причин и колеблется от 0.1% до 4%. Ранее сообщалось о химическом составе эфирных масел побегов четырех видов рододендронов, произрастающих на территории России: рододендрона даурского {Rhododendron dauricum L.), рододендрона Ледебура {Rhododendron ledebouri Pojark.), сихотинского {Rhododendron sichotense Pojark., Worosch.) и остроконечного {Rhododendron mucronulatum (Turcz.) Worosch.) [17]. Имеются также данные о выделении некоторых компонентов эфирного масла рододендрона Адамса, однако эти сведения были получены достаточно давно, когда газохроматографические методы в сочетании с масс-спектрометрией еще не получили широкого распространения. Мы осуществили полный анализ всех компонентов, содержащихся в эфирном масле листьев и стеблей рододендрона Адамса, а также, для сравнения, двух родст 44 венных ему рододендронов — золотистого и даурского.
В исследованных нами образцах эфирного масла Rh. adamsii можно выделить компоненты, присутствующие как в листьях, так и в стеблях растения (табл. 10). Это такие, как: а- и 3-пинены, р-мирцен, цис-Р-оцимен, изоле-ден, аромадендрен, гумулен, р-фарнезен, у-муролен, р-селинен, леден, а-фар-незен, 8-кадинен, транс-неролидол, шпатуленол, Р-элеменон, гермакрон. Эфирное масло стеблей данного растения (образцы 16, 26 и 36) содержит гермакрен Д и гермакрен Б, отсутствующие в ЭМ листьев (1а, 2а и За). При этом наблюдается вариативность содержания компонентов ЭМ в различных образцах исследованного сырья Rh. adamsii в зависимости от времени сбора и срока хранения. Так, например, при длительном хранении собранного сырья заметно увеличивается доля транс-неролидола в ЭМ как листьев (с 18.2% до 29.4%), так и стеблей (с 9.6% до 15.7%). Одновременно с этим наблюдается уменьшение относительного содержания таких мажорных компонентов ЭМ, как гумулен, Р-фарнезен и др. Данный факт может свидетельствовать о том, что транс-неролидол, вероятно, является продуктом превращений других компонентов, присутствующих в растении, а содержание остальных веществ уменьшается вследствие их трансформаций или летучести.
Во всех образцах ЭМ листьев и стеблей Rh. adamsii обнаружен 4-фенил-2-бутанон, содержание которого составляет от 3 до 13%, а также родственный ему 4-фенил-2-бутанол (от 1.9 до 7.4%, отсутствует в ЭМ образца 16). 4-Фенил-2-бутанон близок по своему строению т.н. «кетону малины» 4-(4-гидроксифенил)-2-бутанону, использующемуся в пищевой промышленности и парфюмерии [84]. Табл. 10. Содержание компонентов исследованных эфирных масел рододендронов отно
Компоненты ЭМ стеблей Rh. dauricum идентифицированы полностью, в эфирном масле листьев данного растения определены соединения, составляющие около 92% масла. Следует заметить, что в отличие от Rh. adamsii, мажорные компоненты масла листьев Rh. dauricum не совпадают с таковыми для ЭМ стеблей. В эфирном масле стеблей свежесобранного растения (образец 66, табл. 10) преобладают а-пинен и лимонен, доля каждого из которых составляет больше 19%. Эти, а также некоторые другие соединения с содержанием в ЭМ образца 66 больше 1 % отсутствуют в ЭМ листьев (6а), основными компонентами которого являются кариофиллен (28.3%), гумулен (15.0%), кариофиллен-а-оксид (6.1%) и некоторые другие вещества, составляющие 2-3% масла. Такие результаты свидетельствуют о том, что листья и стебли Rh. dauricum могут заметно отличаться по своему химическому составу, поэтому при его исследовании необходимо сортировать сырье на отдельные части растения.
Выделение метилового эфира (Е)-3-(3,7-диметилокта-2,6-диенил)-2,4-дигидрокси-6-метилбензойной (каннабигерорциновой) кислоты
Изучение состава и содержания тритерпеновых кислот (ТТК) в растительном сырье важно не только с научной (фитохимическое исследование), но и с практической точки зрения - проверки качества сырья, из которого она извлекается. Среди ТТК, присутствующих в растении (урсоловая, олеанолевая, помоловая и др) часто преобладает урсоловая кислота (УК, 8), которая практически всегда сопровождается изомерной ей олеаноловой кислотой (ОК, 9) (и редко — помоловой кислотой).
УК и ОК — тритерпеновые кислоты ряда амирина. Они часто встречаются в различных растениях и характерны для семейств розоцветных и вересковых [13]. УК обладает целым спектром биоактивностей: противораковой [90], антимутагенной, противовирусной, цитотоксической [91], а также противовоспалительной, антигиперлипидемической и промотирующей противораковые эффекты [92, 93]. Все это указывает на актуальность работ, связанных с поиском растений - источников УК и количественным определением УК в этих растениях.
В литературе описано несколько вариантов решения задачи по определению урсоловой кислоты в растительном сырье: методом ВЭЖХ идентифицируются производные УК после деривации и-толуидином, с помощью ВЭТСХ и ВЭЖХ проводят количественный анализ УК в Verbena officinalis и в Potentilla discolor Bge [94], наличие УК подтверждают методами ВЭЖХ-МС [95] и после силилирования методом ГЖХ [96]. Описан нехроматогра-фический тандемный MS-MS способ определения УК в некоторых растения рода Staphylea [97]. Для ряда лекарственных трав, произрастающих в Китае, определение ТТК осуществляли с применением капиллярного электрофореза [98]. При этом нужно учитывать, что количественное определение УК осложняется наличием в растениях ее близкого структурного изомера — олеа-ноловой кислоты, — а также других ТТК и прочих маскирующих соединений. Хроматографическое разделение ТТК между собой требует использования колонок с высокой эффективностью и возможно только в условиях ГХ.
Мы полагаем, что подходящим способом определения количественного содержания УК в растительном сырье является параллельный анализ образцов методами ВЭЖХ и ГХ (или ГХ/МС). При подборе соответствующих условий для ВЭЖХ (элюент, форма градиента, сорбент, скорость элюции и т.д.) можно разделить суммарный пик ТТК и примесные соединения. При невозможности этого разделения в качестве дополнительной обработки мы предлагаем проводить метилирование растительных экстрактов, содержащих УК и ОК, с последующим подбором хроматографических условий для разделения суммарного пика метиловых эфиров УК и ОК.
Зная массовый коэффициент экстинкции (суммарное поглощение света раствором вещества с концентрацией 1 г/л при длине оптического пути 1 см на заданной длине волны) УК и ее метилового эфира и полагая их равными таковым для ОК, по данным ВЭЖХ можно вычислить массу этих кислот в точно взятой навеске экстракта. Разделение пиков, соответствующих УК и ОК, в газохроматографическом анализе позволит вычислить массовое соотношение этих кислот по соотношению площадей этих пиков. В итоге при совместном использовании методов ВЭЖХ и ГХ становится возможным получение полной и достоверной информации о качественном и количественном содержании ТТК в исследуемом сырье. Описываемая схема приведена на рис. 23.
В рамках предлагаемой методики нами были определены массовые коэффициенты экстинкции на длине волны 210 нм для образцов УК и ее метилового эфира, имеющих чистоту не менее 98%, которые составили 9.3 и 5.6 AU/мг соответственно. Также были подобраны хроматографические условия разделения суммарного пика УК и ОК от других компонентов экстрактов растительного сырья (рис. 24). Для упрощения состава экстрактов, полученных из Rh. adamsii, перед экстракцией сырье было подвергнуто гидродистилляции, на примере экстракта Vaccinium praestans Lamb, путем добавления точной навески УК была продемонстрирована надежность и достоверность предлагаемого метода. Данные по массе сырья, полученным экстрактам и содержанию в них УК и ОК приведены в табл. 13.
Как видно из таблицы, содержание УК и ОК в Rh. adamsii не превышает 0.1%, причем соотношения УК/OK для листьев и стеблей близки. В крас-нике {Vaccinium praestans) общее содержание этих кислот выше, чем в клюкве {Oxycoccus palustris), причем доля урсоловой кислоты также больше в Vaccinium praestans. Таким образом, можно рекомендовать жом красники как перспективное сырье для получения УК.
Полученные результаты демонстрируют возможность применения предложенной методики как для экстрактов с низким содержанием УК и ОК (рододендрон Адамса), так и с высоким их содержанием (жомы ягод). С помощью разработанной методики определено количественное суммарное содержание, а также массовое соотношение урсоловой и олеаноловой кислот в листьях и стеблях Rhododendron adamsii Rehd., жоме ягод Oxycoccus palustris и Vaccinium praestans Lamb.
