Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 8
1. Аналоги иуклеозидов. 12
1.1. Аналоги ацикловира. 12
1.2. Аналоги ганцикловира. 17
1.3. Фиксированные модификации аналогов ганцикловира. 20
1.4. Аналоги ганцикловира с заменой атома кислорода па атом серы 21
1.5. Аналоги иуклеозидов „разомкнутые" по С2'-СЗ'-связи. 22
1.6. Аг/иклические аналоги иуклеозидов, содержащие атом кислорода в положении Гили У. 22
1.7. Ациклические аналоги иуклеозидов, содержащие метокси-группу при С-Г атоме 24
1.8. Другие ациклические аналоги. 25
1.9. Аналоги иуклеозидов с циклической структурой 28
2. Амфифильные аналоги иуклеозидов 30
2.1. Эфиры нуклеозидмонофосфатов аналогов иуклеозидов. 30
2.1.1. Алкилъпые и арильные эфиры аналогов иуклеозидов 30
2.1.2. Циклофосфаты аналогов иуклеозидов. 31
2.2. Динуклеозидмонофосфаты. 32
2.3. Фосфолипидные и стероидные производные иуклеозидов. 33
2.4. Эфиры Н-фосфапатов иуклеозидов. 35
3.Фосфонаты аналогов иуклеозидов 35
2 Обсуждение результатов 43
1. Синтез ациклических аналогов иуклеозидов 44
1.1. Синтез аналогов иуклеозидов, содерэюащих цис-пентеновый фрагмент 44
1.1.1. Синтез хщс-пентеиового фрагмента. 44
1.1.2. Синтез аналогов иуклеозидов, содержащих цис-пентеновый фрагмент. 46
1.2. Синтез аналогов иуклеозидов, содерэюащих транс-пентеновый фрагмент и оксиметильную группу в положении 1'цис- и транс- пентенового фрагмента 52
1.2.1. Синтез ациклических фрагментов для получения аналогов нуклеозидов, содержащих трат-пгнтеновый фрагмент и оксимгттъпую группу в положении Г цис- и транс- пентеноеого фрагмента. 52
1.2.2. Получение аналогов нуклеозидов, содержащихтранс-пентеновый фрагмент и оксиметильную группу в положении V цис- и транс- пентеноеого фрагмента 55
1.3. Результаты биологического тестирования ациклических аналогов нуклеозидов. 57
2. Синтез лмфифильных аналогов нуклеозидов и изучение их взаимодействия с модельной мембраной 59
2.1. Синтез 3~0-додецил-1-0-фосфо~5'~(2',3'~дидезокси-2',3'-дидегидро)-тгшидипа (46а, b) 61
2.2. Синтез додецил-(у-2Нз)фосфорилхолииа. 65
2.3. Исследования взаимодействия с мембраной ДФХи коныогата d4T 67
3 Экспериментальная часть 72
1. Материалы и методы 72
2. Биологическое тестирование синтезированных аналогов нуклеозидов. 74
3. Синтез шнтеновыхсинтонов для ациклических аналогов нуклеозидов 75
3.1. Синтез (е)-5-0-ацетил-1~бромпент-2-епа (27) 75
3.2. Синтез (е+2)-5-0-ацетил-1,1~диметоксипепт-2-епа (28) 77
4. Синтез ациклических аналогов гуанозина, 7-деазагуанозинаи7-деаза-аденозина, содержащие щс-гидроксигшнтеновьій фрагмент 80
5. Синтез аі^тилзаііщщнньіхметоксишнтшовьіханмогов нуклеозидов 85
6. Сишезащшлзащищенньіхе-шнтеновьіх аналогов нуклеозидов 86
7. Общая методика деблокигованиягт^оксильной группы аналогов нуклеозидов (2, 3, 4, 5) 87
8. Синтез лмфифильных аналогов нуклеозидов 87
Выводы 92
- Аналоги ганцикловира.
- Динуклеозидмонофосфаты.
- Синтез ациклических фрагментов для получения аналогов нуклеозидов, содержащих трат-пгнтеновый фрагмент и оксимгттъпую группу в положении Г цис- и транс- пентеноеого фрагмента.
- Синтез ациклических аналогов гуанозина, 7-деазагуанозинаи7-деаза-аденозина, содержащие щс-гидроксигшнтеновьій фрагмент
Введение к работе
В настоящее время в биохимии и медицине идет интенсивный поиск новых биологически активных веществ обладающих антивирусными и противоопухолевыми свойствами. Среди потенциальных веществ подобного рода большое внимание уделяется аналогам нуклеозидов, их фосфорным и амфифильным производным. На их основе созданы и внедрены в практику такие препараты, как ацикло-вир, ганцикловир, азидотимидин и др. При включении таких нуклеозидов в цепь ДНК предполагается прекращение дальнейшей элонгации цепи праймера.
Поиск эффективных противовирусных препаратов предполагает модификацию структуры нуклеозида. При выборе направлений химических модификаций необходимо исходить из следующих соображений: 1) поиск вещества, обладающего наибольшей активностью по отношению к молекулярной мишени; 2) модификация структуры нуклеозида, обеспечивающая перенос вещества во внутрь клетки. Такой подход связан с тем, что вещества проявляющие высокую активность по отношению к молекулярной мишени не проявляют активность на клеточном уровне всвязи с затрудненным транспортом через мембрану. Как правило, в процессе транспорта аналогов нуклеозидов через биологические мембраны лимитирующей стадией является их включение в мембрану. Для оценки способности аналогов нуклеозидов преодолевать биологические мембраны, необходим доступный метод изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с мембранами, позволяющий оценить солюбилизирующую способность аналогов нуклеозидов.
Таким образом, актуальными представляются следующие направления работы: синтез новых аналогов нуклеозидов модифицированной структуры с целью поиска наиболее эффективного субстрата вирусных ДНК-полимераз; модификация структуры аналогов нуклеозидов, облегчающих их встраивание в мембрану; разработка метода изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с модельными мембранами, позволяющего сделать сравнительную оценку солюби-лизирующей способности модифицированных аналогов нуклеозидов по отношению к мембранам, для сравнения эффективности дальнейшей модификации аналогов нуклеозидов липофильными фрагментами.
В этой работе описаны; синтез новых ациклических аналогов нуклеозидов, модифицированных как по гетероциклическому основанию, так и по углеводному фрагменту и результаты их биологического тестирования; синтез амфифильных аналогов нуклеозидов, методика изучения их взаимодействия с модельной мембраной с помощью метода ЯМР-спектроскопии.
Аналоги нуклеозидов, модифицированные по гетероциклическому фрагменту, могут обладать более низкой цитотоксичностью и более высокой активностью, чем их предшественники, Среди аналогов нуклеозидов, модифицированных по углеводному фрагменту, особое внимание привлекают ациклические аналоги, не имеющие гидрокси-групп в 2'- и в 3'- положении; при включении 5'-трифосфатов таких нуклеозидов в цепь ДНК предполагается прекращение дальнейшей элонгации цепи праймера.
Полярность аналогов нуклеозидов затрудняет их проникновение через клеточные мембраны. Для решения проблемы транспорта таких соединений внутрь клетки были получены конъюгаты аналогов нуклеозидов с липофильным фрагментом. Разработанная методика предназначена для изучения взаимодействия дейтерий меченных конъюгатов с модельной мембраной и позволяет оценить способность амфифильных аналогов нуклеозидов встраиваться в мембрану. При допущении, что лимитирующей стадией процесса транспорта амфифильных аналогов
7 нуклеозидов является их встраивание в мембрану, предлагаемая методика может стать удобным инструментом более точной оценки возможностей новых амфи-фильных нуклеозидов преодолевать биологические мембраны, чем, применяемый в настоящее время, расчет коэффициента распределения log я.
Целями работы явились: I) синтез новых ациклических аналогов нуклеозидов, обладающих противовирусной активностью и содержащих кратные связи в алкильном фрагменте; 2) установление связи „структура - биологическая активность" синтезированных соединений; 3) для сравнения эффективности дальнейшей модификации аналогов нуклеозидов липофильными фрагментами - разработка метода изучения взаимодействия дейтерий меченых амфифильных аналогов нуклеозидов с мембранами методом гН и 3|Р ЛМР-спектроскопии и 4) с целью отработки этого метода - синтез дейтерий меченого и немеченого амфифильного аналога нуклеозида.
Аналоги ганцикловира.
Ганцикловир также проявляет высокую противовирусную активность (EDJO 0.15 мкМ). Это обстоятельство послужило поводом для синтеза аналогов ганцикловира и их биологического тестирования. В упоминавшейся в первом разделе обзора работе В.Л. Флорентьева [18] описан синтез соединения (18а) (рис. 5). Это соединение обладало значительно меньшей активностью в отношении некоторых РНК-содержащих вирусов, чем ацикловир. Точных значений биологической активности этих соединений в публикациях не приведено. Авторы ограничились лишь общим утверждением что, все соединения проявили значительно меньшую активность в отношении некоторых РНК-содержащих вирусов (при концентрациях в интервале 100-200мкг/мл). Синтезированная Keppeler К. и сотр. группа ациклических аналогов 5-этил-2 -дезоксиуридина (18d, е) 116], биологической активности не проявила. Ogilvie К. К. с сотр. синтезирована серия глицеропуринов (18Ь, с) [24] и модифицированных пуринов (Ш- п, 19) [25], обладающая активностью против вируса герпеса. Наиболее активными оказались производные (18Ь) и (18с), у которых значение EDso составило соотв. 0,13 и 6,6 мкг/мл, и (19g) и (ISh). Значения EDso против вируса герпеса типа 1 для соединений (19g) и (ISh) составили 2,7 и 1,4 мкг/мл соответственно; против вируса герпеса типа 2 - 1,3 и 7 мкг/мл. Этими же авторами проведен синтез тригидроксиациклонуклеозидов (20 и 21) [26], биологическое тестирование которых показало, что введение дополнительной гйдроксиме-тильной группы в З -положение в соединениях (20 и 21) уменьшает их активность по сравнению с (18а). Активность соединения (21) оказалась выше соединения (20). Lazrek Н. В. и сотр. были получены 1-гидрокси-3-азидо-2-пропоксиметил-пиримидины (Thy, Ura, Cyt) (22 -24) (рис. 5) [27]. Сочетание в структуре фрагментов AZT и ацикловира дало синергетический антиретровирусный эффект и повысило их активность в сравнении с аналогичными соединениями без азидо-группы, однако точных результатов биологической активности авторы не привели.
Сравнение результатов биологического тестирования аналогов нуклеози-дов, рассмотренных в этом разделе, позволяет проследить следующие тенденции: 1) противовирусная активность соединений с гетероциклами (18) оказалась ниже, чем у предшественника; 2) изменение ациклического фрагмента, как в соединени- ях (22 - 24) и (19), привело к увеличению биологической активности синтезированных соединений. Исходя из этих тенденций, можно предположить, что структуры ациклического фрагмента у соединений (18), (20), (21) менее эффективны для получения аналогов нуклеозидов с высокой биологической активностью, чем структуры ациклического фрагмента у соединений (1), (22 - 24) и (19). 1.3. Фиксированные модификации аналогов ганцикловира. Гипотеза о влиянии пространственного расположения гидрокси-групп ациклического фрагмента аналогов нуклеозидов на их антивирусную активность определила интерес к аналогам нуклеозидов с фиксированным ациклическим фрагментом. Towensend L. В. и сотр. синтезирован ряд пиримидиновых аналогов нуклеозидов, фиксированных в антиконформации по атому, имитирующему 4 -атом сахара (25 - 27) (рис. 6) [28]. Соединения тестировали на активность против HIV и вируса герпеса. Лишь соединение (27Ь) при нецитотоксичных концентрациях было незначительно активно против HIV. Другие соединения при концентрациях до 100 мкМ были не активны. По результатам этой работы можно сделать предположение, что жесткая фиксация ациклического фрагмента затрудняет участие аналога нуклеозида в построении ДНК не только человека, но и вируса. Это предположение подтверждается результатами биологического тестирования в публикации Kumar А. и сотр. [29], в которой были описаны 2 ,3-секонуклеозиды (28,29), фиксированные по атому, имитирующему 2 -атом сахара, синтезированные размыканием периодатом натрия углеводного фрагмента. Биологические тесты соединений (28,29) активности против HIV не показали. Предполагая, что замена атома кислорода на атом серы в ациклических аналогах нуклеозидов может повысить их антивирусную активность, были синтезированы такие аналоги. Kelley L. J. с сотр. синтезировали ациклические аналоги нуклеозидов (30 -32) (рис. 7), в которых атом кислорода в ациклической части был заменен на атом серы [30]. Замена атома кислорода на атом серы в ациклическом фрагменте привела к существенному снижению анти-ШУ активности аналогов. Результаты тестов позволяют сделать предположение, что атом кислорода в положении 2 ацикличе- 22 ской части играет существенную роль в распознавании иуклеозидов при синтезе ДІЖ в клетке, Синтезированная Keppeler К. и сотр. группа ациклических аналогов 5-этил-2 -дезоксиуридина (33) (рис. 8) [16] антивирусной активности не проявляла. Соединения (34, 35), синтезированные размыканием периодатом натрия углеводного фрагмента, получены Kumar А. и сотр. [29]. Результаты биологического тестирования против HIV отрицательные. 1.6. Ациклические аналоги иуклеозидов, содержащие атом кислорода в по ложении 1 или 3 . Haraden М. R. и сотр. получены 1-(гидроксиалкокси)пиримидины (36, - 38) (рис. 9). Синтез осуществляли циклизацией соответствующих модифицированных производных мочевины с этил-3,3-диэтокси-2-метилпропионатом или с метил-3,3-диметоксипропионатом [31]. Соединения не обладали антивирусной активностью.
Предположение о положительном влиянии атома кислорода в ациклической части аналогов нуклеозидов на биологическую активность последних инициировало синтез новых аналогов нуклеозидов, содержащих метокси-группу при С-Г атоме. Bailey S. и сотр. были синтезированы новые аналога пуриновых нуклеозидов (40 - 42) (рис. 10) и их N-7 замещенные изомеры, в которых сахарный фрагмент заменен на 2 ,3 -гидрокси-Г-метоксипропильный или 3 -гидрокси-1 -метоксипропильный заместитель [33]. Соединения были получены конденсацией соответствующих ацеталей с силилированными азотистыми основаниями и протестированы на антивирусную активность. Результаты биологического тестирования авторы не привели. Карбоаналог 9-[4-гидрокси-3-(гидроксиметил)-1-бутил]гуанина (43) (рис. 11), полученный Tippie М. А. и сотр., проявил высокую активность против вируса герпеса типа 1 и низкую против вируса герпеса типа 2 [34] (ED$o составили 0,5 и 4,0 мкМ соответственно). Можно сделать предположение: атом кислорода в положении 2 ациклического фрагмента не всегда способствует повышению биологической активности. Martin I С. и сотр. получены ациклические аналоги (44) [35]. Ключевой реакцией конденсации являлось взаимодействие 1,2-ангидро-4-0-бензилбутан-1,2,4-триола с избытком соответствующих оснований в присутствии каталитических количеств гидрида натрия. Для соединения (44а) значение ED5o против вируса герпеса типа 1 составило 400 мкМ. Возможно, низкая активность этих соединений свя- зана с тем, что пространственное расположение атома кислорода в их молекулах сильно отличается от расположения в природных нуклеозидах. Vemishetti Р. и сотр. получили 2 -дезокси-2 -фтор-Г,2 -секонуклеозиды (45 -49) [36]. Пуриновые аналога синтезировались достройкой оснований. Пиримиди-новые аналоги - взаимодействием (КД)-2-(хлорметокси)-1,3-бис(бензилокси)-4-фторбутана с сшшлированными основаниями. В дальнейшем, пиримидиновые соединения были превращены в соответствующие 3 ,5 -циклические фосфаттриэфи-ры. Антивирусной активности соединения не проявили. Бутадиеновые аналоги нуклеозидов 9-(4-гидрокси-1,2-бутадиен-1-ил)аденозин (50а) и 1-(4-гидрокси-1,2-бутадиен-1-ил)цитозин (50Ь) синтезированы Zemlicka J, с сотр. [37]. При тестировании против ЩУ соединения проявили высокую активность в сочетании с низкой токсичностью, В продолжение работы с подобными структурами Цытович с сотр. новыми методами, дающими лучшие выходы, были синтезированы 9-(4-гадрокси-1)2-бутадиен-1-ил)-Кб-бензоиладенин (50с) и 1-(4-гидрокси-1,2-бутадиен-1-ил)гуанин (50d) [38]. Биологическое тестирование соединений (50с и d) не проводилось. Moukha-Chafiq О. с сотр. пошли по пути модификации гетероциклов и осуществили синтез соединений (51 и 52) [39].
Динуклеозидмонофосфаты.
К группе динуклеозидмонофосфаты относятся димеры, в которых нуклео-зиды, присоединены по 5 -положениям к фосфатной группе. Предполагалось, что такие соединения с защищенным или свободным фосфатом будут диффундировать в клетки и, метаболшируя, высвобождать либо две молекулы нуклеозида, либо нуклеозид и мононуклеотид. Были изучены как симметричные (67а,Ь) [61], так и несимметричные димеры (67c-g) (Рис. 15) [62, 63]. Результаты испытаний указывают на значительный синергический эффект применения динуклеозидфосфатов, содержащих разные нуклеозиды. Было выяснено влияние направления присоединения нуклеотидов друг к другу путем синтеза и проверки активности динуклеозидфосфатов, содержащих агаА и соединенных тремя возможными способами (5 -5 , З -З , V-S ) фосфодиэфирной связью [64]. Оказалось, что рост некоторых опухолевых клеток эффективно ингибируется 3 -5 -производными. Для обеспечения эффективного транспорта dNMP через клеточную мембрану было предложено использовать фосфолипидные производные нуклеотидов. Существуют две большие группы таких производных: гликолипидные и глицеро-липидные. К первым относятся триэфиры фосфорной кислоты, содержащие в качестве заместителей нуклеозид, остаток D-глюкозы (68а) [65, 66] или D-маннозы (68b,c) (рис. 16) [67, 68, 69] и углеводородную гексадецильную цепочку. Методом ЯМР была показана способность фосфотриэфира (68а) проникать в клетку [64], Выбор углеводного компонента соединений (68Ь,с) объясняется тем, что D-манноза связывается с белками мембраны макрофагов, в которых идет активное размножение HIV, что обеспечивает адресную доставку активного агента - AZT к зараженным клеткам. Свободная гидроксильная группа в 6-ом положении соединения (68с) обеспечивает возможность его фосфотрансферазного транспорта через мембрану. Глицеролипидные В последние годы внимание ряда исследовательских групп привлекли 5 -фосфиты (5 -Н-фосфонаты). Первым синтезирован и изучен в качестве антиметаболита Н-фосфонатом Н-фосфонат AZT. Испытания показали, что Н-фосфонаты, как правило, несколько менее активны, чем родительские нуклеозиды, но в то же время и менее токсичны. Следующими были получены эфиры Н-фосфоната AZT (71а) [73] и динуклеозидное производное (71Ь) (рис, 19) [74]. Эфиры (71) показали большую активность против HIV в культуре клеток С8166, чем свободный Н-фосфонат AZT.
По-видимому, повышенная активность эфиров Н-фосфонатов связана с устранением заряда на фосфоре, что обеспечивает лучшее проникновение этих соединений внутрь клетки. собны к гидролизу с отщеплением липофильного фрагмента и дальнейшему фосфорилированию в клетке с образованием цепи RC-P(0)(0H)-O-P(0)(OH)-0-Р(0)(ОІЇЬ, который при синтезе ДНК вируса может идентифицироваться как трифосфат. Кроме того, фосфонаты не подвергаются в клетке гидролизу связи С-Р. Таким образом, они переходят сразу ко второй стадии фосфорилирования нуклеозидов в клетке - образованию трифосфатов. Между тем, как образование монофосфатов аналогов нуклеозидов в клетке наиболее длительный, избирательный и трудный процесс. Нуклеозиды перед первичным фосфорилированием подвергаются более жесткому распознаванию, чем при дальнейшем фосфор ил ировании, что, при высокой изменчивости вируса, приводит к быстрому образованию новых штаммов, нечувствительных к применявшимся препаратам. Нуклеотидные производные такой природы можно разделить на пять основных групп: (рис.20). Интерес к подобным соединениям обусловлен высокой стабильностью к химическому и ферментативному гидролизу простой эфирной связи в соединениях (72d), ацетальной - в изостерических соединениях (72Ь) или алкильной цепи в соединениях (72с,е), а также фосфоноэфирной связи в соединениях (72а). Фосфонаты пиримидиновых нуклеозидов (73-75) (рис. 21) были синтезированы Holy А. и сотр. [75]. Ни одно из N-I соединений не проявило заметной противовирусной активности. 0-6 Соединения, напротив, проявили неожиданно высокую активность. Были синтезированы также аналогичные О-б замещенным производные, в которых 0-6 атом был заменен на атом S-6. Эти соединения обладали незначительной активностью против ретровирусов. Точных значений ECJO авторы в статье не привели. Серия фосфонатов аналогов пиримидиновых нуклеозидов (76-81) была синтезирована Holy А. и сотр. [76]. N-1 Соединения (76-78) проявили низкую проти-вовоирусную активность. Некоторые 5-замещенные 2,4-диаминопиримидиновые производные, напротив, показали высокую биологическую активность против ретровирусов. Так 5-метилпроизводное (80g) проявило существенную активность против HIV (ЕСзо 0.00018 мкМ/мл), но так же и высокую цитотоксичность. Гало-генпроизводные (81) наряду с высокой активностью (ECJO 0.0023-0,0110 мкМ/мл), сопоставимой с активностью адефовира и тенофовира, обладают низкой цитоток-сичностью (СС50 0.3 мкМ/мл). Новые эфиры фосфонатов аналогов нуклеозидов (82) (рис. 22) - бис-(2,2,2- трифторэтил)овые эфиры 2-амино-6-арилтио-9-[2-(фосфонометокси)этил]пуринов - были синтезированы Kouichi Sekiya и сотр. [77]. Синтезированные соединения проверялись на противовирусную активность (против вируса герпеса). Среди син тезированных соединений бис-(2,2,2-трифторэтил)овый эфиры 2-амино-б- фенилтио-9-[2-(фосфонометокси)этил]пурина, 2-амино-б-(4-метоксифенилтио)-9- [2-(фосфонометокси)этил]пурина, 2-амино-6-(3-метоксифенилтио)-9-[2- -(фосфонометокси)этил]пурина и 2-амино-6-(2-метоксифенилтио)-9-[2- (фосфонометокси)этил]пурина проявили высокую активность, ED50 для них составили соответственно 0,05, 0.03, 0,04 и 0.08 мкМ. Цитотоксичность всех соединений превышала 1000 мкМ.
Большая серия (более 70 соединений) (83-85) фосфонатов ациклических аналогов нуклеозидов синтезирована группой сотрудников под руководством Zidek Z, [78], Эта серия продолжила ряд описанных ранее аналогов. В составе этих соединений присутствует ациклические фрагменты 9-[2-(фосфонометокси)этил], R- и S- изомеры 9-[2-(фосфонометокси)пропил], а азотистые основания представлены аденином и 2,6-аминопурином, замещенными по N-6 положению алкилами, диалкилами, циклоалкилами, алкенилами, алкинилами и замещенными алкилами. Авторами приведены данные тестирования на противовирусную активность против вирусов гепатита и HIV. Наибольшую активность проявили главным образом циклоалкильные производные. Среди этого ряда фосфонатов аналогов нуклеози-дов N-6-изобутил-, N-6-циклопентил- и г4-6-ициклооктил-9-[2-(фосфонометок-си)этил]-2,б-диаминопурин, а так же N-6-диметиламиноэтил-, N-6-циклопропил- и К-6-циклопентил-(К)-9-[2-(фосфонометокси)пропил]-2,б-диаминопурин показали большую активность, чем тенофовир (от 1 до 5 мкМ), и имеют перспективу для создания на их основе противовирусных препаратов. Резюме. В настоящее время поиск новых противовирусных нуклеозидньгх препаратов продолжается по двум направлениям: синтез новых ациклических аналогов нуклеозидов и синтез фосфатов или фосфонатов аналогов нуклеозидов, имеющих подтверждение наличия биологической активности. Анализируя достаточное количество публикаций по биологической активности синтезированных аналогов нуклеозидов, затруднительно выстроить ряд активности описанных соединений. Это связано с тем, что в некоторых публикациях отсутствует информация о биологической активности описанных соединений. В остальных публикациях тестирование соединений проводилось в различных тест-системах, по действию против разных вирусов. Это осложняет сравнение биологической активности соединений описанных разными авторами. Предполагается: соединения обладающие структурой, повторяющей пространственное строение части природных нуклеозидов, будут встраиваться в цепи ДНК. Антивирусное действие аналогов нуклеозидов заключается в ингибировании процесса синтеза вирусной ДНК, например, за счет отсутствия второй гидрокси- группы в положении, имитирующем СЗ -атом природного нуклеозида. Проявления биологической активности можно ожидать от аналогов нуклеозидов с 5 -гидроксипентеновым фрагментом, повторяющим безкислородную часть цикла углеводного фрагмента природного нуклеозида, Возможно, для повышения биологической активности имеет значение также расстояние в молекуле от атома кислорода 5 -гидрокси группы до атомов азота гетероциклического основания. Для проверки этого предположения нами синтезированы цис- и транс-изомеры гидроксипентеновых аналогов нуклеозидов.
Синтез ациклических фрагментов для получения аналогов нуклеозидов, содержащих трат-пгнтеновый фрагмент и оксимгттъпую группу в положении Г цис- и транс- пентеноеого фрагмента.
В качестве ациклических реагентов для получения аналогов нуклеозидов типа (3), (4) и (5) использовали соответствующий ациклический бромид (27) и аце-таль (28), синтез которых приведен на схеме 4. Для получения fEJ-5-ацетокси-І-бромпент-2-ена (27) исходный 1-тетрагидропиранилоксипент-2-ин-1-ол (7) гидрировали в присутствии литийалюмогидрида (выход 50,5%), ацетилировали (выход 97,9%), удаляли тетрагидропиранильную защитную группу в присутствии DOWEX 50 (Н ) (выход 70%) и бромировали тетрабромметаном в присутствии трифенилфосфина (выход 65%). Структура соединений (27), (29), (31) подтверждена с помощью ИК- и Н-ЯМР спектроскопии. В спектрах этих соединений сигнал от протонов при атомах С-2 и С-3 присутствует в виде дублета триплетов с константой спин-спинового взаимодействия 15 Гц, что, при сравнении с описанными в [79] Z-аналогами (околоіі Гц), соответствует ( -конфигурации двойной связи. Диметилацеталь (28) получали окислением 5-ацетоксипент-2-ен-1-ола (10) (получен по методике [86]) диоксидом марганца с последующей ацетализацией триметилортоформиатом (выход 66 %). Уже на стадии окисления спирта (10) в альдегид (32) происходит изомеризация двойной связи, что приводит к образованию смеси (2+/)-5-ацетоксипент-2-ен-1-алей в эквимолярном количестве (по данным Н-ЯМР спектроскопии). (Разделение (2)- и (Z -изомеров проводили после получения аналогов нуклеозидов. До этой стадии реакции проводили со смесью изомеров.) Так в спектре реакционной смеси (рис. 3) соединению (10) соответствуют два набора сигналов от протонов при атомах С-2 и С-3 : дублет триплетов при 6,35 м.д. и неразрешившийся сигнал, вероятно тоже дублет триплетов, 6,18 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия 11,1 Гц (Z-двойная связь) и дублеты триплетов при 7,01 и 6,80 м.д. константой спин-спинового взаимодействия 15,7 Гц ( -двойная связь). Интегральная интенсивность сигналов этих двух групп протонов одинакова и соответствует одному протону, что свидетельствует об эквимолярном соотношении (Z)- и (Е)- изомеров. Структура соединений (28) подтверждена данными ИК- и Н-ЯМР-спеетроскопии. Синтез аналогов нуклеозидов проводили для соединений (3) по ранее отработанной нами методике [79] (схема 5). Для этого в конденсацию с бромидом (27) вводили триметилсшшльные производные пиримидиновых оснований (33) и (34) и натриевую соль аденина (35).
После деблокирования соединения (36) насыщенным аммиаком в метаноле целевые ( гидроксипентеновые производные тимина (Зс)} цитозина (ЗЬ) и аденина (За) получены с выходами на исходный бромид (27) 67, 69 и 73 %, соответственно. Строение аналогов нуклеозидов (3) подтверждено данными УФ- и -ЯМР-спектрами (табл. 5). Конденсацию тимина (33) и цитозина (34) со смесью (I)- и (ф-ацегалей (28) (схема 5) проводили при комнатной температуре в ацетонитриле в присутствии четыреххлористого олова по методике, предложенной для конденсации азотистых оснований с ацеталями в работах Флорентьева и соавт, [87, 88, 89]. (Z)- И (Е)-изомеры ациклических аналогов нуклеозидов (37a-d) после стадии деблокирования гидроксильной группы разделяли методом тонкослойной препаративной хроматографии (выделение оптических изомеров по ГС-атому пентенового фрагмента не производили). Деблокирование ацетилзащищенной гидроксильной группы в тех же условиях, что и для соединений (3) привело к соединениям (4) и (5). Суммарные выходы (в расчете на смесь (Z)- и -изомеров) составили: для производи Биологическое тестирование аналогов нуклеозидов (1-4) проводилось в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н, Ф. Гамалеи, РАМН, группой сотрудников под руководством Г. Г. Миллер, Результаты тестирования приведены в таблице 6. Предположение о зависимости биологической активности от расстояния между атомом кислорода 5 -ОН группы и атомом азота (N-1 или N-9) гетероцикла подтверждается результатами тестирования биологической активности: (I)-аналоги (1а-с, 2а) проявили большую активность, чем (2 -аналоги (За-с). Замена N-7 атома азота в гетероциклах на атом углерода не привела к повышению биологической активности аналогов нуклеозидов с ациклическим фрагментом f -Cj. Это следует из результатов тестирования для 7-деазасоединений (2Ь и 2с) и анало- гов нуклеозидов с не модифицированными гетероциклами (la и 2а). Введение метокси-группы в положении Г (соединения (4 и 5)) как и предполагалось, повысило активность аналогов нуклеозидов относительно соответствующих аналогов нуклеозидов без метокси-группы (соединения (lb, с и ЗЬ, с)). Таким образом, установлена связь биологической активности: а) с удаленностью 5 ОН-группы от атома азота гетероцикла (N-1 - для пиримидиновых и N-9 - для пуриновых аналогов нуклеозидов), б) с наличием Г-метоксигруппы, атом кислорода которой вероятно имитирует атом кислорода рибозного цикла. Поиск новых противовирусных препаратов включает синтез новых соединений с последующим биологическим скринингом. Однако не все новые соединения оказьшаготся активными как на молекулярном, так и на клеточном уровне. Это может быть связано с трудностью образования монофосфатов аналогов нуклеозидов в клетке, а также с трудностью преодоления аналогами нуклеозидов клеточных мембран. Липофильные фрагменты, присоединенные к действующим на молекулярном уровне веществам, способны облегчить их транспорт через мембрану. Логичным продолжением работы в направлении получения новых противовирусных препаратов является синтез конъюгатов фосфатов аналогов нуклеозидов с ли-пофильными фрагментами.
В этом направлении определенную сложность представляет выбор липофильного фрагмента для конъюгата. Предварительно оценить липофильность вещества можно с помощью расчета коэффициента распределения в системе изооктанол/вода - Log я. Так, напри- мер, для 2 ,3 -дидезокси-2 ,3 -дидегидротимидина значение Log я составляет -0,488, а для 3-0-додецил-1-0-фосфо-5 -(2 ,3 -дидезокси-2 ,3 -дидегидро)-тимидина 5,676 (обработано при помощи программы DayLight). Однако значение Log я не всегда линейно соотносится со способностью веществ проникать через мембрану, Более близким к этой способности по природе взаимодействия может оказаться исследование встраивания веществ в модельную мембрану. Для сравнения влияния липо-фильных фрагментов на солюбилизирующие свойства конъюгатов нами разработан метод изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с модельной мембраной. В работах [90,91] уделялось внимание изучению взаимодействия с мембранами амфифильных молекул, взятых в больших концентрациях, близких к ККМ. При концентрациях амфифильных молекул, существенно меньших ККМ, начальные стадии их взаимодействия с мембранами правсгически не изучались. Из всех возможных методов исследования мембранных массообменных процессов наиболее информативным нам представляется метод ЯМР спектрометрии на ядрах дейтерия и фосфора. Известно, что дейтериевые метки не изменяют химических свойств препаратов и не влияют на их солюбилизирующие свойства. Фосфитилирующий агент - 2-цианоэтилтетраизопропилфосфородиамидит (38) получали в две стадии. На первой стадии получали дихлорцианоэтилфосфит (39) из треххлористого фосфора и цианоэтанола. На второй стадии к дихлорциано-этилфосфиту (39) прибавляли диизопропиламин. Дейтерий-меченый додеканол (40Ь) получали изотопным обменом, восстанавливая метиллаурат литийалюмодей-теридом LiAl Н4. Далее синтез дейтерий-меченого и немеченого конъюгатов вели по общей методике. На первой стадии получали З-О-додецил-І- Д-диизопропиламидо)-цианоэтилфосфит (42а) и 3-0-а-2Н2-додецил-1-(ЛгД-диизопро-пиламидо)-цианоэтилфосфит (42Ь), взаимодействием 2-цианоэтилтетраизопропил-фосфородиамидита (38) с, соответственно, додеканолом и а-2Н2-додеканолом в присутствии диизопропиламмонийтетразолида (41). Затем, на второй стадии, полученные 3-0-додецил-1-(МД-диизопропиламидо)-цианоэтилфосфиты (42а, Ь) вводились в реакцию с d4T (43). Таким образом, были получены дейтерий-меченый и немеченый 5 -0-(0-додецилцианоэтилфосфит)-2 ,3 -дидезокси-2 ,3 -дидегидротимидин (44а, Ь), которые, без выделения, окисляли mpem-бутилгидроперекисью до 5 -0 (р-додецилцианоэтилфосфо)-2 ,3 -дидезокси-2 ,3 -дидегидротимидина (45а, Ь). Далее продукт (45а, Ь) обрабатывали последовательно трютиламином и натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).
Синтез ациклических аналогов гуанозина, 7-деазагуанозинаи7-деаза-аденозина, содержащие щс-гидроксигшнтеновьій фрагмент
Смесь диэтилацеталя бромуксусного альдегида (5,00 г, 26,0 ммоль), этил-, цианоацетата (12,82 г, 103,0 ммоль), К2СОэ (2,94 г, 22,1 ммоль) и KI (0,23 г, 1,4 ммоль) кипятили 6 ч. Полученную коричневую суспензию разбавляли водой (100 мл) и экстрагировали дютиловым эфиром (3x500 мл). Органические экстракты объединяли, сушили Na2SC 4, растворитель удаляли в вакууме. Полученную темно-коричневую жидкость наносили на колонку (5x60 см) с силикагелем, элюировали смесью петролейный эфир-этилацетат, 1:1, Фракции, содержащие продукт, концентрировали в вакууме. Выход 4,32 г (67%), бесцветное масло. Rf 0,67(система А). 4-Амино-6-гидрокси-5 (2.2-диэтоксиэтил)-2-меркаптопиримидин (18), Раствор эфира (16) (1,22 г, 5 ммоль), тиомочевины (0,38 г, 5 ммоль) в 20 мл абс. DMF добавили к раствору 5 ммоль EtONa в 5 мл абс, этанола, полученную смесь кипятили 6 ч. Полученный темно-желтый раствор упарили с 6 г силикагеля и нанесли на колонку (5x30 см) с силикагелем, элюировали смесью хлороформ-метанол 95:5. Фракции, содержащие продукт, объединяли, растворитель удаляли в вакууме, остаток кристаллизовали из толуола. Выход 0,86 г (64%), светло-желтые иглы. Т пл. 168С(разл.), Rf0,40(система ВЗ). 4-амипо-6-гидрокси-5-(2.2-дизтоксизтил)пирітидші (20). Суспензию 1,4 г пиримидина (Зммоль) (18) и 3 г никеля Ренея кипятили в 50 мл дистиллированной воды, содержащей 3 мл 25% NH4OH 6 ч. По окончании реакции (контроль ТСХ в системе В) смесь фильтровали, осадок промывали горячей водой, фильтраты объединяли, концентрировали в вакууме, остаток растеряли в минимальном количестве абс. этанола. Раствор охлаждали до 0С, образовавшийся осадок отфильтровывали. Выход 0,86 г (75%), оранжевые кристаллы. Т пл. 190-192С. Маточный раствор упаривали с 2 г силикагеля, дополнительные 0,18 г продукта выделяли колоночной хроматографией на силикагеле в системе В. Rf 0,38 (система В). 6-гидрокси-2.4-диамшіо-5-(2.2-дизтоксизтімі)пііримидші (17). Раствор 0,9 г (5 ммоль) гидрохлорида гуанидина в 5 мл абс, этанола перемешивали с 5 ммоль EtONa и в течение 1 ч, фильтровали, фильтрат добавляли в раствор 1,21 г (5 ммоль) (16) и 2,5 ммоль EtONa в 10 мл абс. этанола. Реакционную смесь кипятили в течение 6 ч, охлаждали, упаривали с 5 г силикагеля и наносили на колонку (5x50 см) с силикагелем. Элюировали смесью хлороформ-метанол (система ВЗ).
Фракции, содержащие продукт, объединяли, растворитель удаляли в вакууме, остаток кристаллизовали из абс. этанола. Выход 0,98 г (82%), светло-бежевые призмы. Т пл. 17б-178С. Rf 0,49 (система В). 2-Амшіо-4-гидрокси-пирролої2.3-(11пиримидин (19). Раствор 0,23 г (0,95 ммоль) пиримидина (17) в 4,5 мл 0,2н. НСІ перемешивали в течение 1 ч при 20С. Реакционную смесь нейтрализовали IN NaOH, продукт отделяли фильтрованием и сушили 12 ч в вакуумном эксикаторе над P Oj, а затем 12ч, в вакуумном сушильном шкафу (0,5 мм рт. ст,) при 50С Выход 0,12 г (88%), бесцветные иглы. Т пл. 340С. Rf 0,14 (система В). 4-Гіідроксипирроло[2.3-{Цпиримш)ші (21). Раствор 0,500 г (1,77 ммоль) пиримидина (20) в 10 мл IN НС1 перемешивали 1 ч при 20С. Реакционную смесь обрабатывали как для (XI). Выход 0,246 г (86%), светло-желтые кристаллы. Т пл. 340-343С. Rf 0,18 (система В). 4 ХЛорпирроло[2.3-(Нпирцлшдин (23). Суспензию 1,23 г (10 ммоль) соединения (21) в 15 мл хлорокиси фосфора (24,75 г, 89,1 ммоль) кипятили в атмосфере аргона в течение 1,5 ч (до образования прозрачного раствора). Избыток хлорокиси фосфора удаляли в вакууме, остаток обрабатывали 10 г льда. Полученную суспензию фильтровали, нейтрализовывали IN NaOH и экстрагировали эфиром (3x50 мл). Органические экстракты объединяли, сушили над прокаленным Na2$04 и упаривали. Полученное твердое вещество кристаллизовали из этилацетата. Выход 1,07 г (79%), серые кристаллы. Т пл. 186-188С. Rf 0,38 (системаВ). 2-алшпо-47хлорпирроло[2.3-(1/паримидин (22). Получали аналогично (23) из 0,20 г (19) после 6 ч кипячения с хлорокисью фосфора. Кристаллизовали из толуола. Выход 0,11 г (50%), светло-коричневые кристаллы. Т пл. 215-217С. Rf 0,30 (система В). Синтез аналогов nvweowdoe (2а, Ь и с). (Схема 2, стр, 47) Метод А, К суспензии 1 ммоль соответствующего основания (11,22 или 23) в 15 мл, абс. DMF при перемешивании в токе аргона добавляли гидрид натрия (1,2 ммоль, 80% суспензия в вазелиновом масле), перемешивали 0,5-1ч при 20С, затем добавляли алкилирующий агент (6), через 2 ч смесь подвергали стандартной обработке (см. ниже). Метод Б. К перемешиваемой суспензии КОН в 20 мл. абс. ацетонитриле добавляли 0,1 ммоль 18-краун-б и перемешивали 10 мин., после чего добавляли 1 ммоль соответствующего гетероциклического основания (11, 22 или 23). Смесь перемешивали 30 мин, после образования осадка калиевой соли гетероциклического основания добавляли бромид (6) (1 ммоль) и реакционную смесь выдерживали 4 ч при 20С. Нерастворимый материал отфильтровывали и далее смесь подвергали стандартной обработке. 2-амиио-9-(5-сщетилоксжент-2-ен-1-ил) 6 хлорпурип (12), 7-(5- щетилоксипент-2-ен-1-ил)4-хлорпирроло[2,3-(і]пиримидип (25) и 2-а\тно-7-(5-щетилоксипешп-2 еп 1-ил)-4-хпорпирроло[2,3-с1]пиримидин (26) получены по методам А и Б после стандартной обработки в виде светло-желтых (соединение (12)) или светло-коричневых (соединения (25) и (26)) кристаллов.
Выходы продуктов конденсации приведены в табл. 1, Т пл. - в табл. 1 (стр. 51). При хроматографиче-ском выделении соединения (25) из первых фракций элюента (хлороформ-метанол, 98:2) выделено 28 мг. (8%) ди-замещенного пирроло[2,3-с1]пиримидина (24). Спектральные характеристики приведены в табл. 2 (стр,53), 3 (стр. 53) и 4 (стр. 56). 9-(5-Ґидроксипент-2-ен-1-илкуаішп (2а). Вещество (12) (149 мг, 0,5 ммоль) кипятили в 5 мл 0,1N NaOH 4 ч, затем раствор нейтрализовывали, образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали на фильтре водой и абс. метанолом. Кристаллизовали из смеси метанол-вода 1:1. Выход 78 мг (66%), светло-серые кристаллы. 2-Амино-7-(5-гидроксипент-2-еп иііп)пирра7о[2іЗ-(Іїпиршшдип (2b). Вещество (25) (280 мг, 1,06 ммоль) растворяли в 15 мл метанола, насыщенного аммиаком и нагревали а автоклаве при 110С 36 ч. После охлаждения реакционную смесь подвергали стандартной обработке (система В). Выход 192 мг (85%), желтые кристаллы. 2-Лмино-4-гидрокси-7-(5-гидроксипепт-2-ен-1 ил)пирроло123-й]пиримидип(2с), Аналогично (2а), из 395 мг (1,43 ммоль) соединения (26) получено 183 мг (2с) (56%), светло-коричневые кристаллы. Обработка реакционных смесей. После завершения процесса реакционную смесь фильтровали, фильтрат упаривали, остаток сушили 2 ч при 20С, 0,1 мм рт. ст., растворяли в 20 кратном количестве метанола, в полученный раствор добавляли силикагель (1:50 по массе), растворитель удаляли в вакууме при 20С. Сорбированное таким образом вещество наносили на колонку с силикагелем(3х25 см), элюировали хлороформом, постепенно повышая полярность системы добавлением метанола (линейный градиент) до значений системы ВЗ. Общий объем элюента для соединений - 1 л. Фракции, содержащие индивидуальное вещество, объединяли, растворитель удаляли в вакууме, остаток после сушки (2ч при 20С, 0,1 мм рт. ст.), кристаллизовали из указанных в соответствующих методиках растворителей. Спектральные характеристики соединений (2а - с) приведены в таблицах 2 и 3 (стр. 48). 5. Синтез ацетилзащищенных метоксипентнновых аналогов нуклео- зидов. Схема 5, стр. 56. (Z+E)-]-(5-0-Auemuj-1-MemoKcunenm-2-en-l-iw)muMun (37h, d). К 0,25 г (2,0 ммоль) тимина (34) добавляли 20 мл ацетонитрила и 3 мл BSA, затем кипятили до полного растворения. Далее охлаждали, прибавляли раствор 0,25 г (1,33 ммоль) (2+Е)-5-0-ацетил-1,1-диметоксипент-2-ена (28) в 3 мл ацетонитрила и 186 мкл (0,414 г, 1,6 ммоль) тетрахлорида олова и перемешивали 48 часов. По окончании реакции добавляли 20 мл хлороформа и обрабатывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали хлороформом (3 раза по 20 мл), растворитель удаляли, остаток хроматографировали. Выход: 0,23 г (63 %), в расчете на смесь (Z)- и (Е)- изомеров. Разделение смеси (Z)-и (Е)- изомеров на этой стадии не проводили. (1-\-Е)-1-(5-0-Лиетил 1-метоксипепт-2-еп-1-ил)иитп1ии (37а. с). К 0,22 г (2,0 ммоль) цитозина (33) добавляли 20 мл гексаметилдисилоксана и 1 мл триметилхлорсилана, затем кипятили до полного растворения.
