Введение к работе
Актуальность темы. Гипохлорит-анион (ОСТ) - один из важнейших
метаболитов кислорода, образующихся при активации полиморфноядерных
лейкоцитов. На его образование расходуется 28% Ог от общего количества,
потребляемого нейтрофилами при респираторном взрыве. Актуальность настоящего
исследования определяется необходимостью расширения представлений о механизме
действия гипохлорита на клеточном уровне, выявления ведущих звеньев этого
процесса и факторов, влияющих на степень гипохлорит-индуцированного окисления
мембран. До недавнего времени, реакциям этого соединения с липидами - главными
структурными компонентами мембран - придавалось мало значенім Между тем,
известно, что окислительная модификация липидов может приводить к изменению
физико-химической организации мембраны, которое вызывает нарушение ее
барьерной функции.
Другой мишенью гипохлорита в организме могут быть различные компоненты плазмы крови человека. Описаны случаи спонтанной активации нейтрофилов in vivo, в результате чего может происходить окисление компонентов плазмы гипохлоритом непосредственно в кровяном русле. С другой стороны, модифицированные в результате различных физико-химических воздействий липопротеины (ЛП) являются важным фактором нарушения липидного обмена. Возможно, что одной из причин появления модифицированных ЛП является их окисление гипохлорит-анионом. Кроме того миелопероксидаза (МПО), катализирующая образование ОСТ, была найдена в атеросклеротическом очаге поражения сосудов, и это принято считать доказательством существования реальной основы окисления ЛП in vivo гипохлоритом
Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение особенностей модификации гипохлоритом липидов липопротеинов и липосом in vitro,
а также продуктов этого взаимодействия. Дня достижения этой цели были поставлены | следующие задачи:
-
выявить изменения липидных фракций разных классов ЛП под действием ОСТ и параллельно изучить способность ЯП подвергаться гипохлорит-индуцированному ПОЛ,
-
изучить влияние холестерина на гипохлорит-индуцированное ПОЛ фосфатидилхолиновых липосом,
-
идентифицировать образующиеся в результате окисления производные холестерина в составе ЛД холестерин/фосфатидилхолиновых липосом гипохлоритом натрия.
Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе изучено влияние холестерина (ХС) на гипохлорит-индуцированное перекисное окисление липидов. Показано, что холестерин, встроенный в фосфатидилхолиновые (ФХ) лшгасомы (отношение ХС/ФХ=1), усиливает гипохлорит-индуцированное окисление фосфолипидов при мольном соотношении гипохлорит:холестерин 1. Определено, что липиды ЛНП наиболее подвержены окислительным изменениям под действием ОСТ по сравнению с ЛОНП и ЛВП. Деструкция затрагивает не только липиды, расположенные во внешнем слое (фосфолипиды и холестерин), но и неполярные, расположенные в ядре частицы ЛП (триглицериды и эфиры холестерина). Накопление вторичных продуктов ПОЛ (малонового диальдегида) при гипохлорит-индуцнрованном окислении липидов в ЛП отражает степень деградации липидов в них.
Установлено, что в исследованных системах окисления (липосомах из яичного фосфатидилхолина, димиристоилфосфатидилхолина и коллоидной дисперсии) образуется одинаковый набор продуктов окисления холестерина, отличающихся лишь
содержанием полярных соединений. Набор оксипроизводных холестерина, образующихся после его взаимодействия с гипохлоритом, не зависит от степени доступности ХС (микрокристаллы, липосомы, коллоидная дисперсия). Повышенное содержание полярных фракций ХС отмечается при его окислении в липосомах, содержащих фосфатидилхолин с ненасыщенными двойными связями. При окислении ХС s дисперсии образуется незначительное количество сильно полярных соединений, причем их содержание снижается с уменьшением рН среды.
При взаимодействии гипохлорита с ХС выявлено, что изменение структуры ХС происходит только по С-3, С-б и С-7, и в смеси продуктов не обнаружено ни одного производного, окисленного по углеводородному хвосту. Кроме того, найдено 3 диеновых соединения и несколько соединений с положением двойных связей, отличным от положения двойной связи в ХС.
Научно-практическое значение работы. Впервые было описано образование такого большого числа продуктов взаимодействия ХС с OCt (18 продуктов). Гипохлорит-анион является не только бактерицидным или цитотоксическим соединением, но и," вероятно, обладает некоторым регулирующим действием на различные стадии воспалительного процесса. Это действие, возможно, опосредуется через различные оксипроизводные холестерина.
Разработан метод окисления холестерина в коллоидной дисперсии, а также
препаративного разделения и идентификации оксипроизводных холестерина. > Апробация диссертационной работы. Основные положения научных
исследований доложены на международном симпозиуме "Эндогенные интоксикации"
(Санкт-Петербург, 1994), на итоговой научно-практической конференции НИИ
физико-химической, медицины (1995) и на совместной конференции отделов
биофизики и.биохимии НИИ физико-химической медицины.
Публикации. По результатам дисертационной работы опубликовано 3 статьи в центральной печати.
Структура и обіем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 22 рисунка. Перечень цитируемой литературы включает 193 источника: 38 отечественных и 155 зарубежных.
Обзор литературы. Обзор литературы состоит из шести частей, которые информируют о современных представлениях об образовании гипохлорит-аниона в организме, его взаимодействии с различными органическими соединениями и о механизмах повреждения гипохлоритом клеток и липопротеинов. Представлены данные по общей характеристике МПО (фермента, катализирующего образование гипохлорит-аниона) и путях образования гипохлорит-аниона МПО. Особое внимание уделено взаимодействию ОСІ с липидами мембран и ЛП. Гипохлорит-анион реагирует с ненасыщенными липидами по молекулярному механизму с образованием более полярных соединений- хлоргидринов [Winterbourn.1992], в результате чего образуются поры в мембране и нарушается ее проницаемость. Но, с другой стороны, показано, что гипохлорит-анион может инициировать и другой механизм повреждения мембран -ПОЛ [Stelmaszynska, 1992; Панасенко, 1992] В настоящее время нет однозначного мнения и относительно взаимодействия гипохлорит-аниона с холестерином. Кроме оксппроизводных [Van der Berg, 1993], образуются также и хлоргидрины холестерина [Heinecke, 1994] Необходимо отметить, что данных об их биологическом эффекте нет.
Большой интерес представляет участие гипохлорит-аниона в окислении ЛП, поскольку МПО была обнаружена в очаге атеросклеротнческого поражения сосудов in vivo [Daugherty,1994]. В связи с этим, ЛП, модифицированным гипохлорнтом, придается большое значение как важному фактору нарушения липидного обмена. [Heinecke,1995].
Материалы и методы. Гипохлорит натрия получен электрохимическим методом путем электролиза водного раствора NaCI на установке " ЭДО-3" [Сергненко, 1990]. Использовалась также и синтетическая НОСІ ("Serva"). Липосомы, содержащие холестерин, получали инжекцией спиртового раствора фосфатидилхолина и холестерина в интенсивно перемешиваемый фосфатный буфер с последующим разбавлением (Batary, 1973]. Размер полученных липосом составил 200 нм (данные получены методом фотон-корреляционной спектроскопии на лазерном нефелометре Autosizer Не "Malvern"). Коллоидную дисперсию ХС получали впрыскиванием хлороформного раствора холестерина и стабилизирующего ПАВ (блоксополнмера окиси этилена и окиси пропилена) в воду или фосфатный буфер с различными рН при 50-60С с последуюЬим удалением хлороформа под вакуумом Выделение ЛНП из плазмы крови человека проводили методом препаративного ультрацентрифугирования в растворах NaBr с соответствующей плотностью [Lindgren, 1975].
Разделение продуктов окисления холестерина проводили на хроматографе фирмы "Gilson" на колонке с прямой фазой Nucleosil 50-5 ("Machery Nagel") 250x4.6 мм в системе гексан.изопропанол (95:5) при скорости элюирования 1 мл/мин с использованием УФ-детектора UV116 (213нм) и дифференциального рефрактометра "LDC". Приблизительная оценка содержания ХС и обнаруженных продуктов его окисления была проведена по площадям пиков на хроматограмме
ТМС-производные получали действием садильного агента (N,0-бис(триметилсилил)трифтор-ацетамида) в пиридине (объемное соотношение 1:1) при 60С [Turk, 1983] и анализировали с помощью газового хроматографа, снабженного масс-спектрометрическим детектором в режиме ионизации электронным ударом (Hewlett-Packard, MSD 5970В). Разделение компонентов смесей проводили на капиллярной колонке Fused Silica Capillary Colomn HP-1 (12м х 0.2мм х 0.33 мкм). Начальная температура колонки - 240С (1 мин) с последующим нагревом до 300С (скорость нагрева 8 7мин).
Экспериментальная часть.