Введение к работе
Актуальность проблемы. Липосомы представляют сооой замкнутые везикулы, образованные одной или несколькими двуслойными липидными мембранами в водной среде, и являются удобной моделью для изучения свойств липидкых бислоев. В настоящее время открывается перспектива использования липосом в качестве переносчиков лекарственных веществ в организме [Oatro, 1987].
Липосомы могут взаимодействовать с клетками разными путями, а именно: (1)адсорбироваться на клеточной поверхности; (2)сливаться с плазматической мембраной; (3)"захватываться" клетками (эндоцитоз) и (4)обмениваться липидами с клеточной мембраной. Во многом взаимодействие будет определяться типом клеток и строением их мембраны. Считается, что именно слияние липосомы с мембраной клетки-мишени обеспечивает наиболее эффективное "внедрение" экзогенных веществ, связанных с липосомами, в клетку. Этим, в частности, объясняется большой интерес исследователей к проблеме слияния липосом с клеточными мембранами.
Цель исследования. В настоящей работе рассматривается взаимодействие липосом с эритроцитарной мембраной. До сих пор слить эритроцитарную мембрану с липосоыальной удавалось лишь с помощью капсульних белков некоторых вирусов [Inque et al., 1985]. Тем не менее, высокая лидирующая активность этих белков в отношении клеточных мембран ограничивает их применение в экспериментах с живыми клетками. Главная цель нашего исследования - добиться слияния липосом с эритроцитами при условии сохранения клетками жизнеспособности. Однако прежде всего необходимо было разработать методику, с помощью
которой можно бьшо бы проводить количественную и качественную оценку взаимодействия липосом с эритроцитами.
Научная новизна работы. Исследована роль липидов (фосфатидилсерина PS, фосфатидилхолина PC, фосфатидил-этаноламина РЕ, холестерина Ch), входящих в состав липосом, при Са^+-опосредованном взаимодействии липосомальной и эритроцитарной мембран. Установлены зависимости адсорбции и слияния не только от наличия В' липосомах отрицательно заряженного фосфатидилсерина и концентрации ионов кальция в среде, но и от содержания в их мембранах холестерина. Найдено, что в одних и тех же условиях интактные эритроциты взаимодействуют с липосомами менее эффективно, чем их тени, полученные путем гемолиза эритроцитов в гипотонической среде. Показано, что обработка проназой снижает способность эритроцитарной мембраны адсорбировать липосомы в присутствии ионов кальция, а также сливаться с ними.
Обнаружено, что после обработки электрическим импульсом суспензии эритроцитов с липосомами, адсорбированными на клеточной поверхности при помощи полилизина, возможно слияние эритроцитарной и липосомальной мембран. Установлена необходимость набухания эритроцитов, вызванного электрообработкой, для того, чтобы это слияние состоялось. Найдено, что экзогенный гемоглобин способен связываться с поверхностью эритроцитов, предварительно обработанных полилизином. Результатом этого является подавление набухания эритроцитов после электрообработки, а также предотвращение их слияния с липосомами.
Практическая ценность. Отработана методика и предложены рассчетные формулы, позволяющие оценивать адсорбцию липосом на
поверхности клеток и слияние липосомального материала с клеточной мембраной.
Подобран состав липосом, способных сливаться с эритроцитами в присутствии ионов кальция в физиологической концентрации - 1мМ, что открывает перспективу проведения экспериментов In vivo.
Электрический импульс, не приводящий к гемолизу эритроцитов, также может быть, использован в целях слияния липосом с эритроцитами.
Апробация работы. Основные результаты работы
докладывались на объединенном семинаре отделения биофизики и лаборатории мембран Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, USA, 19-94) ; на семинаре лаборатории биоэлектрохимии мембран Института электрохимии РАН (1995). Работа апробировалась на заседании кафедры биофизики МВФ РГМУ (1995).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 научных работы, названия которых приведены в конце автореферата.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части (результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа состоит из трех глав и изложена на /во страницах, включая J> таблицы и рисунков. Список литературы содержит ссылок.
Приготовление липосом. Липосомы готовились методом экструзии. Смесь четырех липидов (PS, PC, РЕ, Ch) и флуоресцентного красителя родамин-фосфатидилэтаноламина Rh-PE (5 моль% во всех экспериментах) в хлороформе подвергалась вакуумному выпариванию на ротационном испарителе. Сухая пленка липидов смывалась буфером и ресуспендировалась. Полученная
суспензия продавливалась через поликарбонатные фильтры с порами определенного диаметра. Средний размер липосоы определялся методом лазерного светорассеяния ("NICOM" Particle Size System). Для экспериментов по Са2+-индуцированному слиянию готовились липосомы диаметром 80-100нм; в экспериментах по электрослиянию использовались липосомы с большим диаметром - около 200 нм.
А. Са2+-нндугшрованное взаимодействие штосом с мембраной эритроцита
Объект и основные растворы. Эксперименты проводились на кроличьих эритроцитах и их тенях. Основной средой служил изотонический фосфатный буфер (150mM NaCl, 5mM NaP^, рН 7.35).
Приготовление теней эритроцитов. Тени готовились по методу Dodge (1963), согласно которому к отмытым и осажденным эритроцитам добавлялся гипотонический фосфатный буфер (150 mOsm). Отмытые тени ресуспендировали в изотоническом буфере в концентрации 1010/мл. В отдельных экспериментах тени инкубировали в специальном солевом растворе (125mM NaCl, 5тМ КС1, 3.8тМ СаСІг, 2.5тМ MgCl2, 5тМ TRIS-HC1, рН 7.4) в течение 1 часа при 37С с целью получения замкнутых теней.
Инкубация и флуоресцентные измерения. Инкубация эритроцитов (или их теней) с липосомами протекала в присутствии ионов кальция ( до 3 мМ ) при температуре 37С в течение 2-3 часов. В ряде опытов перед инкубацией с липосомами -эритроциты -обрабатывались—проназой—Е—(-1—мг/мл,—30—мин,—ЗТ^От-После инкубации с липосомами клетки (или тени) осаждались, содержащий свободные липосомы супернатант удалялся. Если липосомы инкубировались изначально с эритроцитами, то непосредственно перед флуоресцентными измерениями из эритроцитов готовились тени. В итоге полученные тени ресуспендировали в изотоническом фосфатном буфере и измеряли
интенсивность флуоресценции до и после доставления детергента тритона Х-100 (0.1%). Интенсивность флуоресценции образцов (Хех - 500 nm, Хещ - 585 nm) измерялась на спектрофлуориыетре "SLM-AMINCO 8000".
Определение ассоциации и слияния липосомального материала с мембраной эритроцита. В работе использовались липосомы, содержащие липидный флуоресцентный краситель в концентрации, при которой происходит тушение флуоресценции. При адсорОции таких липосом на клеточной мембране интенсивность флуоресценции образца не меняется. Однако, как только часть липосомального материала попадает в клеточную мембрану (в результате слияния, полуслияния или липидного обмена), происходит разбавление красителя, результатом чего является увеличение флуоресценции образца. На основе этого была произведена оценка взаимодействия липосом с эритроцитарной мембраной. Общее количество липосомального материала, связанного с одной клеткой, N (моль/клетка), и та его часть, которая слилась с клеточной мембраной ("индекс слияния"), F (%), рассчитывались по следутадим формулам:
д = z<3i*-~x*>
»41
(1)
І8І-ІЬ
Н, % = — = 100%
* - Х (2,
где їді и Igit ~ интенсивность флуоресценции клеточно-липосомальной суспензии/ соответственно, до и после добавления детергента; 1^ и I^t - интенсивность флуоресценции липосо-мальной суспензии, соответственно, до и после добавления детергента; 1^ - интенсивность флуоресценции буфера; R -
исходное количество липосомального материала, приходящееся на одну клетку во время инкубации (моль/клетка); к - коэффициент тушения липосомальной суспензии:
k - (Iit-IfcJ/di-Ib) (3>
Б. Слияние дипосом с эритроцитами, индуцированное электрическим импульсом Объект и основные растворы. В экспериментах использовались человеческие эритроциты. Базовым раствором служил HEPES-буфер (5мМ HEPES, 150MM-NaCl, 300 raOsm, рН 7.4). В специальных экспериментах в буфер добавляли декстран (5 mM HEPES, 142 тМ NaCl, 15 тМ dextran (8.8 kDa); 300 mOsm; рН 7.4). Раствор полилизина в HEPES-буфере (200 цг/мл, 8kDa, Sigma) готовился в силиконовой пробирке перед каждым экспериментом.
Электрослияние.Процедура электрослияния обычно проводится в три этапа: (1) приведение в контакт взаимодействующие мембраны; (2) наложение высоковольтного электрического импульса и (3) инкубация в определенных условиях.
1. Прикрепление липосом к поверхности эритроцитов. Липосомы (PS/PC/Ch/Rh-PE в молярном отношении 10:40:45:5) прикреплялись к несушей отрицательные заряды эритроцитарной мембране с помощью полилизина. С этой целью эритроциты сначала "покрывались" 'положительно заряженным полилизином (20цг/мл): их инкубация протекала при 4С в течение 15 мин. Обработанные
-полилизином эритроцитьг-инкубировались с—липосомами—( 37—Сг
15 мин. ). После удаления супернатанта эритроциты ресуспенди-ровали в 1 мл буфера.
2.Электрообработка. Экспоненциальный импульс (Е-0.1-3 кВ/см, т1/2~-*~0-5 мс) получе-пи с помощью высоковольтного импульсного генератора (Model Permeator ЕС-102, Electrocell Inc., NY). Эритроциты с липосомами, прикрепленными к клеточной
поверхности с помощью полилизина, подвергались действию единичного электрического импульса в специальной пластмассовой кювете, в которую помещались два плоскопараллельных золотых электрода с расстоянием между ними 2 мм и объемом 1 мл.
3. ИыкуСация. После электрообработки эритроциты инкубировались в этой же кювете в течение 30 мин. при 37С.
Флуоресцентные измерения. Обработанные электрическим импульсом эритроциты лизировались добавлением дистиллированной воды, их тени промывались и в итоге ресуспендировались -в HEPES-буфере. Интенсивность флуоресценции измерялась до и после добавления детергента Triton Х-100 (0.1%) при А^х - 500 nm и Хеш - 585 nm на спектрофлуориметре "SLM-AMINCO 8000". Индекс слияния липосомального материала с эритроцитарной мембраной (F,%) рассчитывался по формуле (2).
Определение гемолиза. Гемолиз эритроцитов, подвергшихся электрообработке, определялся по концентрации гемоглобина в супернатанте методом поглощения при 415 им.
Определение набухания эритроцитов методом гематокрита. 5цл суспензии эритроцитов череа определенные промежутки времени набирались в гематокритные капилляры и центрифугировались в специальной центрифуге (Model MB, Intematianal Equipment Co., Boston, MA) при 10,000g в течение 1.5 мин. Затем измерялась высота седиментов, образованных эритроцитами (hg) и супернатантом (hs). Отношение V-he/hs представляет относительный объем клеток в суспензии. Относительное набухание эритроцитов рассчитывалось как:
S,% - (V/Vq) 100% (4) где V и V0 - относительные объемы, соответственно, обработанных и необработанных электрическим импульсом клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ А. Са^+-иидуіпгрованное взаимодействие липосом с мембраной эритроцита
Роль фосфолипидного состава липосом. Опираясь на полученные данные, мы можем предложить по крайней мере два механизма связывания липосом с тенями. Первый механизм, обусловленный взаимодействием ионов кальция с отрицательно заряженным фосфатидилсерином внешнего слоя липосомальной мембраны, приводит не только к адсорбции (рис.1а), но и к слиянию (рис.lb). Нелинейная зависимость индекса слияния F от содержания PS в липосомальньсс мембранах, имеющая скачок между 5-10 моль% PS (рис.lb), может быть объяснена перераспределением PS между внутренним и внешним слоями липидного бислоя. Известно, что фосфатидилсерин в концентрациях менее 5-7моль% локализуется в основном во внутреннем слое мелких однослойных липосом и появляется во внешнем слое при концентрации приблизительно 10 моль%.
2.0
? ..о
Z 0.5 ю
о *- 0.0
і г"
—-»-
л
Ї-
-і
&?
IPSl mol%
а).
5 10 15 го
bPS4^md% ь).
Рис.1. Зависимость взаимодействия липосом с тенями эритроцитов от содержания PS в липосомальных мембранах при разных концентрациях Са^+ в среде. По оси абсцисс: содержание PS в мембранах липосом (моль!). По оси ординат:а - ассоциация липосом с тенями N, нмоль/тень (nmol/gho3t); b - индекс слияния F (%). Липосомы ( 10 моль% РЕ, 45 моль% Ch, 5 моль% Rh-PE, содержание PS менялось за счет PC ) инкубировались с тенями в течение 3 ч. в отсутствие ( А ) и в присутствии 1мМ (X), 2мМ (), 3 (В) мМ
гя2+-
1.5
1.0
2.0
0.5
0.0
б*
5 10 15 [PEl mol% b).
Рис.2. Зависимость взаимодействия липосоы с тенями эритроцитов от содержания РЕ в липосомальных мембранах. По оси абсцисс: содержание РЕ в мембранах липосом (моль%). По оси ординат:а - ассоциация липосом с тенями N, нмоль/тень (nmol/ghoat)} Ь - индекс слияния F (%). Липосомы ( 10 моль! PS, 45 моль% Ch, 5 моль% Rh-PE, содержание РЕ менялось за счет PC ) инкубировались с тенями в присутствии 3 мМ са2+ в течение 3 ч.
1.5
1.0
0.5
0.0
&?
[CM md%
а).
10 20 "30 40
[Chi md%
Рис.3. Зависимость взаимодейстьия липосом с тенями эритроцитов от содержания Ch в липосомальных мембранах: По оси абсцисс: содержание Ch в мембранах липосом (моль %). По оси ординат:а - ассоциация липосом с тенями N, нмоль/тень (nmol/ghoat); b - индекс слияния F (%). Липосомы ( 10 моль% PS, 10 иоль% РЕ, 5 моль% Rh-PE, содержание Ch менялось за счет PC ) инкубировались с тенями в присутствии 3 мМ Са2+ в течение 3 ч.
Второй механизм, обусловленный взаимодействием ионов кальция с нейтральными фосфолипидами PC и РЕ, приводит лишь к адсорбции липосом на поверхности тени и требует более высокой концентрации ионов кальция в среде (2-3 мМ). О неспецифичности связывания Са2+ с PC и РЕ в данных условиях говорит тот факт, что замена до 15 моль% PC на РЕ практически не сказывается на характере связывания ( рис.2а ) и слияния ( рис.2Ь ) липосомального материала с эритроцитарной мембраной.
Однако оба механизма начинают эффективно "работать" только при содержании холестерина в липосомальных мембранах более 35 моль% (рис.За,Ь). Максимальная адсорбция и слияние достигаются при 45 моль%. Известно, что холестерин в концентрациях порядка 45 моль% сильно изменяет физико-химические свойства фосфолипидных мембран, в частности, способствует доменизации липидов. При концентрации менее 30 моль% холестерин распределен более или менее равномерно. При повышении концентрации холестерин преимущественно локализуется во внутреннем монослое, где цепи упакованы менее плотно, чем в наружном. При концентрации около 50 моль% холестерин начинает формировать "кристаллы" на поверхности липосом, закрывая собой домены фосфолипидов и места связывания с ионами кальция [РМІІірз, 1990]. Это, по-видимому, приводит
1с резкому снижению способности липосом адсорбйроват бся на
эритроцитарной мембране, а также сливаться с ней.
Роль мембраны эритроцита. Было установлено, что в одних и тех же условиях эритроциты взаимодействуют с липосомами намного слабее, чем их тени. Очевидно, это связано с тем, что мембрана тени эритро^шта по своей структуре отличается от мембраны самой клетки.
Тени эритроцитов, приготовленные по методу Dodge (1963), имеют тот же размер, что и сами эритроциты, и не являются инвертированными. Гемолитические поры в тенях закрываются при инкуОации в солевом растворе (125 юМ NaCl, 5 mM КС1, 3.8 тМ СаСІ2, 2.5 МдСІ2, 5 тМ TRIS-HC1, рН 7.4) при Э7С в течение часа. В наших экспериментах замкнутые и незамкнутые тени не отличались в плане взаимодействия с липосомами. Это свидетельствует о том, что подавляющее число липосом вступает во взаимодействие с внешней стороной мембраны тени, а не с внутренней.
Фосфолипиды, формирующие липидный матрикс мембраны нативного эритроцита, ассиметрично распределены между внешним и внутренним слоями липидного бислоя. В частности, весь отрицательно заряженный PS в норме прочно связан электростатическими силами со спектрином с внутренней стороны мембраны. При различных повреждениях цитоскелета, в том числе при гипотоническом шоке, связь между PS и спектрином нарушается, и PS появляется во внешнем слое мембраны [Dressier et al., 1983]. Не исключено, что увеличение адсорбции липосом на поверхности тени по сравнению с адсорбцией на мембране клетки связано, а том числе, и с наличием PS в наружном монослое мембраны тени.
Тем не менее, не имеющая во внешнем, контактном, слое PS, мембрана эритроцита в присутствии ионов кальция способна не только связываться, но и сливаться с PS-содержащими липосомами. Можно предположить, что определенную роль в этом играет гликокаликс, состоящий в основном из несущих отрицательный заряд гликопротеинов. Если эритроциты предварительно обработать пронаэой, которая, действуя на протеиновые участки гликокаликса, изменяет его структуру, то
связывание (и слияние) таких эритроцитов с липосомами значительно ослабеет. То же наблюдается и в' эксперименте с тенями, приготовленными из обработанных проназой эритроцитов.
По-видимому, имеется несколько путей связывания эритроцитарной мембраны с липосомами. Так, возможна свягь гликокаликса и липосом посредством ионов Са**-, При концентрации Са^4" 2-3 мМ возможна связь и с нейтральными фосфолипилами (PC,РЕ) мембраны эритроцита. У теней добавляется еще и связь с PS, который появляется во внешнем слое мембраны при разрушении спектриновой сети. В формировании "чувствительных" к слиянию мест не исключено участие и других компонентов клеточной мембраны, например, мембранных белков. Б. Слязшас двпосом с эритроцитами, индуцированное электрическим импульсом
Слияние и электрогемолиз. Идея основного эксперимента следующая: эритроциты сначала "покрываются* положительно заряженным полилизином, а затем инкубируются с PS-содержащими липосомами. После удаления свободных липосом суспензия обрабатывается электрическим импульсом, инкубируется, а затем подвергается стандартному флуоресцентному анализу. В первой серии экспериментов суспензия эритроцитов с адсорбированными на поверхности липосомами в HEPES-буфере обрабатывалась экспоненциальным единичным электрическим импульсом длительностью О.Змс и амплитудой до 3 кВ/см (рис.4, кривая 1). Было найдено, что индекс слияния F растет с увеличением силы импульса приблизительно до 0.6 кВ/см, однако затем резко падает и после 1 кВ/см не фиксируется.
Мы предположили, что увеличение слияния при низких амплитудах и его угнетение при высоких амплитудах - это разные по механизмам явления. Эти явления могут являться результатом двух известных в настоящее время эффектов, оказываемых на
&*
E.kV/cm
Рис.4. Слияние липосом с
эритроцитами (F,*) в зависимости от
силы электрического импульса.
Эритроциты с адсорбированными
липосомами обрабатывались электрическим импульсом (1^/2-0. Змс) в HEPES-буфере в отсутствие (1) и в присутствии 15 мМ декстрана (2) .
Рис.5. Зависимость гемолиза эритроцитов (Н,%) от силы электрического импульса.
Покрытые полилизином эритроциты
обрабатывались электрическим
импульсом (Ті/2-О.Змс) в HEPES-буфере в отсутствие (1) и в присутствии 15мМ декстрана (2).
эритроциты электрическим импульсом, - набухания и гемолиза [Kinosita and Tsong, 1977a,b,c].
Электропорация эритроцитов может вызвать их гемолиз. На
рис.5 показана зависимость гемолиза от амплитуды
электрического импульса. Сравнивая данные, представленные на рис.4 (кривая 1) и рис.5 (кривая 1), мы предположили, что гемолиз и слияние могут коррелировать друг с другом: когда начинается гемолиз, слияние подавляется (при Е»0.6-0.8 кВ/см). Слияние и набухание.- Эритроциты, подвергшиеся электро-обработке, набухают. Их коллоидно-осмотический лизис может быть предотвращен, если уравновесить внешнее осмотическое давление с цитоплазматическим. Для этого во внешний раствор нужно добавить крупные молекулы, которые не могут проникать
через электропоры внутрь эритроцита [Kinosita and Tsong, 1978; Тзопд, 1987; Serpersu et al., 1985]. Как изображено на рис.5 (кривая 2), присутствие 15 .\й*1 декстрана в растворе сильно подавляет гемолиз эритроцитов после обработки электрическим импульсом. Более того, флуоресцентные измерения показывают, что если эритроциты с липосомами на поверхности подвергнуть такой же обработке в присутствии 15 мМ декстрана, то индекс слияния крайне низок и не имеет пиковой .зависимости (рис.4, кривая 2).
Сравнивая зависимости слияния (рис.6) и набухания (рис.7) эритроцитов от времени, можно отметить, что в первые 1-2 мин. после импульса ни слияния, ни набухания реально не наблюдается, а своих максимальных значений оба эффекта достигают примерно через 30 мин.
&?
О 10 20 30 40.' 50 60
t, mh
-РистйтЗависимость—слияния
эритроцитов (F, %) с липосомами
от времени инкубации после
электрообработки.
Эритроциты с адсорбированными липосомами обрабатывались электрическим импульсом (О.бкВ/см, 0.25мс) и инкубировались в HEPES-буфере.
Рус-Т, чаяигиипсть набухания эритроцитов
(S,%) в HEPES-буфере от времени
инкубации после электрообработки
(О.бкВ/см, 0.25МС).
(1)-набухание эритроцитов, обработанных полилизином; (la,lb,1с)-набухание эритроцитов, обработанных полилизином, а присутствии 50цл гемолизата; (2)-набухание эритроцитов, не обработанных полилизином; (2а)-набухание эритроцитов, не обработанных полилизином, в присутствии 5Оції гемолизата.
Влияние экзогенного гемоглобина на набухание эритроцитов и на их слияние с липосомами. Было установлено (рис.7), что если эритроциты обработать электрическим импульсом, не вызывающим гемолиза, то разницы в набухании покрытых (кривая 1) и непокрытых (кривая 2) полилизином клеток практически нет. Таким образом, полилизин не влияет на способность эритроцитов набухать после действия импульса. Очевидно также, что причина, по которой происходит угнетение набухания и слияния, должна быть связана с гемолизом эритроцитов, который начинается при импульсах, превышающих 0.7-0.8 кВ/см.
Чтобы получить гемолизат, 10' эритроцитов лизировали в 1 мл дистиллированной воды. 50 цл гемолизата добавляли к обработанным и необработанным полилизином эритроцитам. На рис.7 показано, что: 1) если покрытые полилизином клетки обрабатываются электрическим импульсом в присутствии гемоглобина, то они реально не набухают (кривая 1а); (2) добавление гемоглобина в разное время после импульса останавливает набухание покрытых полилизином клеток (кривые lb и 1с); (3) свободные от полилизина эритроциты одинаково набухают как в отсутствие (кривая 2), так и в присутствии (кривая 2а) гемоглобина.
Флуоресцентные измерения показали, что 10цл гемолизата значительно уменьшают индекс слияния, а 50цл полностью его угнетают. При этом не имеет значения, обработана ли суспензия в присутствии гемоглобина, или гемоглобин добавлен сразу же после импульса. Полученные. данные не могут быть интерпретированы в свете коллоидно-осмотического эффекта, так как концентрация внешнего гемоглобина очень мала (порядка 10~б М) и реально не влияет на осмолярность буфера.
Взаимодействие между полилизином и гемоглобином. К эритроцитам, обработанным полилизином, добавили воду. Через 10 мин. тени осадили, супернатант удалили. После двухкратной отмывки водой было измерено поглощение при А.-415 нм полученной суспензии теней. Измерения показали, что после инкубации в собственном гемолизате тени, приготовленные из обработанных полилизином эритроцитов, поглощают сильнее, чем тени из интактных клеток, взятые в качестве контроля. Это дает основание предположить, что гемоглобин связывается с полилизином на клеточной поверхности.
Число молекул гемоглобина Пщ), которые могут расположиться на поверхности эритроцита в один слой, приблизительно составляет 3-10'. Число связавшихся с эритроцитом молекул гемоглобина, паз' можно определить, измерив поглощение при Х-415 нм суспензии теней. Отношение nas к Пщ, показывает, сколько "слоев" формирует связанный полилизином гемоглобин около поверхности эритроцита. Согласно проведенным измерениям и последующим вычислениям, в результате добавления 50 цл гемолизата (в котором содержится столько же гемоглобина, сколько в 5% эритроцитов в образце) вокруг клеточной поверхности образуется по крайней мере 4-5 слоев гемоглобина, что оказывается достаточным для подавления набухания оставшихся целыми клеток и предотвращения их слияния с липосомами.
Механизм слияния эритроцитов с липосомами. Максимальный трансмембранный потенциал Ац>т, который возникает при наложении внешнего электрического поля Е на "полюсах" равномерно суспедированных клеток сферической формы, определяется как:
Діуш - 1.5-E-R где R - радиус клетки.
Протеиновые каналы открываются при Дч»т « 50 мВ, а в липидном матриксе порообразование начинается при Дч'т " 150-400 ыВ [Tsong, 1992]. Таким образом, при действии электрического импульса силой Е - 0.5 кВ/см на эритроциты радиусом R - 5 рм, трансмембранный потенциал составляет 375 мВ. Этого достаточно, чтобы перфорировать мембрану эритроцита, но не липосомы.
Шанс образования поры в мембране эритроцита непосредственно в месте контакта мал, тем Солее, что липосома не обязательно прилегает к эритроцитарной мембране, а может удерживаться на некотором расстоянии от нее нитями полилизина. Механизм слияния, согласно которому пора в одной мембране (в данном случае это только эритроцитарная мембрана) индуцирует образование поры в прилегающей мембране, маловероятен по той хе причине.
В литературе имеются данные о том, что электрический импульс модифицирует поверхность клетки, приводя к перераспределению заряженных компонентов на мембране и дестабилизируя липидный бислой [Sugar et al., 1987]. Кроме этого, электрооОработка приводит к набуханию эритроцита, которое, гак оказалось, способствует слиянию. Обнаружилось, что гемоглобин, выходящий из гемолизировавшихся клеток и связывающийся с полилизином на поверхности эритроцита, способен предотвращать набухание. Не исключено, что крупные молекулы гемоглобина могут блокировать поры, образующиеся в эритроцитарной мембране в результате электрообработки,- и тем самым препятствовать быстрой диффузии ионов по концентрационному градиенту вглубь клетки. Чем плотнее "гемоглобиновое кольцо" вокруг эритроцита, тем лучше он "защищен" от набухания и последующего слияния с адсорбированными на его' поверхности липосомами. Вполне
вероятно, что молекулы гемоглобина могут препятствовать также и сближению эритроцитарной и липосомальной мемОран, необходимому для успешного слияния.
В первой части работы была исследована роль липидов (PS, РЕ, PC, Ch), входящих в состав липосомальных мембран, и подобраны условия, при которых липосомы адсорбируются на эритроцитарной мембране и сливаются' с ней. В нашей системе таковыми являются: включение в липосомы не менее 10 моль% PS и 45 моль% Ch, а также присутствие в среде порядка 2 мМ Са2+.
Во второй части работы решался вопрос о возможности использования электрического импульса для слияния липосом с эритроцитами. Было найдено, что обработка электрическим импульсом суспензии эритроцитов с липосомами, адсорбированными на их поверхности с помощью полилизина, в определенных условиях может привести к слиянию. В этом случае роль электрического импульса заключается в том, чтобы вызвать необходимые изменения эритроцитов, в частности, их набухание. Не исключается также, что электрический импульс на время дестабилизирует клеточную мембрану, что увеличивает вероятность слияния. При импульсах длительностью 0.3-0.5 мс и амплитудой, превышавшей 0.8 кВ/см, начинается гемолиз эритроцитов. Гемоглобин, выходя в окружающую среду, связывается с полилизином на поверхности клеток и препятствует их набуханию и последующему слиянию с липосомами. Достаточно, чтобы в образце гемолизовались всего 4-5% эритроцитов, и набухание остальных будет полностью подавлено.
Слияние же клеточной и липосомальной мембран путем одновременного разрыва в месте контакта под действием электрического импульса маловероятно. Это вытекает из
полученных экспериментальных результатов и подтверждается литературными данными по электропорации, согласно которым сила импульса, лимитированная выживаемостью клеток, не достаточна для образования пор в мембране липосом.