Введение к работе
Актуальность темы. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли липидов, в частности фосфолипидов (ФЛ), в функционировании биологических мембран путем воздействия на мембраносвяэанные ферменты. Возможность осуществления подобных функций обусловлена тем, что липидное микроокружение является активным фактором, определяющим структурные, каталитические, динамические и, соответственно, функциональные особенности мембранных белков, как интегральных, так и периферических. Оно достаточно мобильно и динамично, чувствительно к изменениям окружающей среды, что, в определенной степени, достигается благодаря процессам флип-флоп, латеральной диффузии и возможностям метаболических взаимопревращений компонентов лшшдного микроокружения белка, переходом одних форм липидов в другие и, соответственно, изменением конформации этого микроокружения. Модификация структурных и динамических свойств липидов способствует модификации структурных, динамических и каталитических свойств находящихся в их окружении белков (Бурлакова, 1977, Newton, 1993).
Объектом наших исследований является медьсодержащий фермент дофамин-р-монооксигеназа (ДБМ; КФ 1.14.17.1), локализованный в хромаф-финных гранулах (ХГ) и катализирующий один из ключевых этапов биосинтеза норадреналина. В гранулах существует две формы фермента -мембранная и растворимая. Мембранная форма фермента является одним из периферических белков мембраны ХГ. В экспериментах in vitro показано, что в гидрофильной среде, электрофоретически гомогенные препараты обеих форм практически идентичны по структуре, каталитической активности и иммунологическим характеристикам. Однако, две из четырех субъединиц мембранной дофамин-р-монооксигеназы (мДБМ) содержат дополнительный гидрофобный пептид, отсутствующий у растворимой ДБМ (рДБМ), что обуславливает определенные различия их свойств в амфифильном окружении (Scotland, Ljoines, 1979, Stewart, Klinman, 1988).
Несмотря на то, что исследованиями ДБМ занимаются уже много лет, на сегодняшний день все еще имеются неразрешенные вопросы
2 касающиеся отмеченного фермента. Так не ясен функциональный смысл
локализации фермента в обеих (мембранной и растворимой) фракциях ХГ. Кроме того не ясно, что составляет основу мембранного якоря мембранной формы фермента. Совершенно не изучена функциональная роль липидного окружения мембранной формы фермента и возможное влияние мембранных липидов на его структуру и каталитические свойства.
Цель и залачи исследования. Основная цель настоящего исследования состояла в изучении молекулярных механизмов взаимодействия мДБМ с липидами. В рамках отмеченной задачи планировалось изучить воздействие различных индивидуальных липидов, в частности, ФЛ на каталитическую активность фермента, а также исследовать процесс ассоциации фермента с ФЛ и влияние на этот процесс ряда факторов окружающей среды. В процессе всех экспериментов, параллельно с мДБМ, исследовалось также взаимодействие с липидами рДБМ. Сравнительный анализ полученных результатов в значительной степени облегчил интерпретацию экспериментальных данных и способствовал выявлению специфических для мДБМ особенностей во взаимодействии с ФЛ.
Научная новизна результатов, полученных в работе. Выявлено специфическое модулирующее воздействие ряда индивидуальных ФЛ на реакции, катализируемые ДБМ: фосфатидилхолин (ФХ) и лизофосфа-тидилхолин (лФХ) повышают, а фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидил-серин (ФС) и фосфатидная кислота (ФК) понижают эффективность катализируемой ферментом реакции. Показано, что воздействие ФЛ на каталитическую активность мДБМ обусловлено модуляцией кинетических параметров, катализируемой ферментом реакции. На основании полученных данных, с учетом того, что некоторые из отмеченных ФЛ-модуля-тров входят в состав непосредственного липидного микроокружения мДБМ, выдвинуто предположение о возможной регуляторвой роли ФЛ in vivo в отношении отмеченных реакций и, соответственно биосинтез норадре-налина.
Установлено, что мДБМ образует обратимый комплекс с везикулами, сформированными как из индивидуальных цвиттерионных ФЛ-активаторов
фермента, так и из суммарной фракции ФЛ мембран ХГ. Процесс ассоциации фермента с фосфолипидными везикулами (ФЛВ), специфичен и зависит как от его третичной, так и от четвертичной структуры.
Показано, что. в стабилизации комплекса фермент - ФЛВ принимают участие как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия. Сравнительный анализ эффективности комплексообразования мДБМ и рДБМ с ФЛВ позволяет сделать вывод об участии гидрофобного пептида мДБМ в стабилизации комплекса фермент-ФЛ на мембране гранул.
Научно-практическое значение работы. Данные о молекулярных механизмах воздействия липидов на каталитические свойства ДБМ, а также комплексообразования фермента с ФЛВ могут быть использованы в исследованиях по изучению общих принципов, лежащих в основе липид-белковых взаимодействий.
Впервые представлены данные, свидетельствующие о возможной роли фосфолипидного микроокружения на реакции гидроксилирования дофамина. Эти данные открывают возможности целенаправленного поиска путей контролируемых воздействий на процесс биосинтеза гормонов и нейромедиаторов катехоламиновой природы.
По ходу проведения настоящего исследования найдены новые методические подходы к постановке экспериментов в модельных системах белок-ФЛВ, которые могут быть применены в области экспериментальной биологии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II Всемирном Конгрессе по Теоретической Органической Химии (Торонто, 1991), на VIII Международном Симпозиуме по Биологии Хромаффинных Клеток (Эдинбург,- 1995) и на двух республиканских конференциях. Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Института Молекулярной Биологии НАН РА (1996).
Публикации По теме диссертации опубликованы 6 научных статей.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, общих выводов и библиографического указателя. Первая глава посвящена обзору литературы по теме диссертации, в первой
части которого представлены современные представления о взаимодействии периферических ферментов с липидами. Во второй части обзора рассмотрены основные данные о структурных, каталитических и функциональных характеристиках ДБМ. Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования, использованных в работе. В третьей главе представлены результаты собственных исследований и их обсуждение.
Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, содержит 13 рисунков и 5 таблиц. Библиография включает 105 названий источников отечественной и зарубежной литературы.