Введение к работе
Актуальность .темы. Изучение агентов, способных избирательно связываться с ДНК и производить определенные изменения на генетическом уровне уже достаточно давно вызывает повышенный интерес, поскольку такие агенты имеют большие перспективы использования для медицинских и молекулярно - биологических целей.
Способность олигонуклеотидов определенного состава образовывать триплекс с двунитевой ДНК является важным свойством, позволяющим рассматривать олигонуклеотида как инструменты для внесения изменений в работу генов. Но, как выяснилось, некоторые свойства олигонуклеотидов, в частности их нестабильность в клетках и клеточных экстрактах, их связывание с не полностью комплементарными сайтами, препятствуют их успешному применению. Это стимулировало создание химических аналогов олигонуклеотидов, стабильных в клетке и сохраняющих ДНК - связывающие свойства. Особое место среди таких синтетических агентов занимает синтезированная в 1991 году ІШК (пептидно - нуклеиновая кислота), представляющая собой химеру, имеющую остов близкий к белковому, к которому присоединены азотистые основания. При этом образуется структура, гомоморфная ДНК (Nielsen Р.Е., Egholm Н., Berg R.H., Buchardt О., Science, 1991, 254, 1497).
ПНК обладает достаточно большой силой связывания с ДНК, избирательностью по последовательности и очень высокой стабильностью в клеточных экстрактах. Одним из главных недостатков ПНК, с которым сталкиваются исследователи при попытках ее использования - это связывание с неполностью комплементарными сайтами на' ДНК, характерное и для олигонуклеотидов. Изучение возможности повышения специфичности связывания - это очень важная проблема, имеющая решающее значение для применения ПНК.
Способность ПНК специфически связываться с определенными (в том числе и весьма редкими) сайтами на ДНК позволяет надеяться на возможность использования ПНК в качестве агента для создания искусственных редкощепящих рэстриктаз, имеющих потенциально
широкие возможности практического применения, в частности, для картирования геномах ДНК.
Созданию искусственной редкощепящей рестриктазы на основе различных ДНК-связыващих агентов (белков, олигонуклеотидов, олигонуклеотидных аналогов) были посвящены многие исследования. Изучаемая в настоящей работе возможность применения для этой цели ПНК вносит определенный вклад в решение этой задачи.
Целью настоящей работы было:
1. Изучение возможности применения ПНК в качестве ДНК-
связывавдего агента, способного осуществлять защиту определенных
сайтов от метилирования для создания искусственной редкощепящей
рестриктазы по принципу "Ахиллесовой пяты".
2. Исследование возможности повышения специфичности
связывания ПНК с ДНК за счет меньшей температурной стабильности
неспецифических ПНК-ДНК комплексов.
Научная новизна и. практическая ценность. В данной работе впервые установлена возможность создания искусственных редкощепящих рестриктаз на основе метода "Ахиллесовой пяты" с применением ПНК. Такого рода искусственные рестриктазы могут оказаться важным инструментом при работе с длинными геномными ДНК.
В работе продемонстрировано, что ПНК способна защищать от метилирования непосредственно прилегающие к сайту ее связывания сайты для метилазы на плазмиде.
Впервые показано, что диссоциация неспецифических комплексов
ПНК-ДНК при нагревании может быть использована для повышения
специфичности связывания ПНК с ДНК. Этот метод может представлять
определенную практическую ценность для решения ряда прикладных
-задач ,-связанных-С'ПрименениемПНК^ —
Апробация. Материалы работы докладывались на Ежегодной научной конференции ИМТ РАН (Москва, 1995), на заседании Ученого совета ИМГ РАН (Москва, 1995), на Третьем международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, 1995).
Публикации. По теме диссертации имеются 2 публикации и 2 приняты к печати.
Структура и объем работы, диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитированной литературы. Работа изложена на ?4 страницах машинописного текста, включающих 20 рисунков и 3 таблицы. Список литературы содержит 84 наименований.