Взаимодействие альфа-токоферола со свободными жирными кислотами как нерадикальный механизм стабилизации биологических мембран Скрыпин, Василий Иванович

Введение к работе

Актуальность проблемы

Среди множества факторов, определяющих устойчивость и нормальную жизнедеятельность биологических систем, значительную роль играет структурно-функциональное состояние биологических мембран. Известно также, что в обеспечении структурно-функциональной стабильности биологических мембран ключевую роль играют токоферолы (витамин Е), нарушение уровня содержания которых приводит к разнообразным патологическим отклонениям [Dam et al., 1958; Zalkin et al., 1960; Bieri et al., 1970]. Вместе с тем, молекулярные механизмы стабилизирующего действия витамина Е на биологические мембраны до настоящего времени однозначно не определены. Имеется ряд гипотез, предлагающих различные механизмы действия витамина Е. Наиболее распространенной и получившей широкое экспериментальное подтверждение является антиоксидантная гипотеза, согласно которой основной или даже единственной функцией витамина.Е является защита мембранных фосфолипидов от окислительной деструкции [Tappel, 1972; Grams et al., 1972a; Иванов и др., 1979, 1986; McCay, 1985]. Однако в настоящее время накоплен значительный материал, позволяющий сделать вывод, что антиокислительная активность токоферолов не является их единственной функцией в биологических мембранах. В частности, среди альтернативных гипотез внимание привлекает концепция Люси-Диплока [Lucy, 1972; Diplock et al., 1973; Maggio et al. 1977], согласно которой структурно-функциональная стабилизация мембран а-токоферолом осуществляется за счет стерического взаимодействия между метильными группами токоферола и двойными связями жирнокислотных цепей фосфолипидов, в результате чего достигается более плотная укладка гидрофобных цепей липидов в мембране. Важнейшим следствием этой гипотезы является возможность прямого влияния а-токоферола на такие фундаментальные параметры мембраны, как микровязкость липидной фазы, трансмембранный потенциал, пассивная проницаемость, фазовое состояние липидного бислоя.

Интерес к антиоксидантной гипотезе механизма действия витамина Е во многом объясняется тем, что перекисное окисление липидов в биологических мембранах является одним из двух физиологически и патофизиологически значимых способов модификации липидных мембран. Вторым способом модификации является гидролиз фосфолипидов фосфолипазой А₂, в результате которого образуются свободные жирные кислоты (СЖК) и лизофосфолипиды, появление

которых в составе биомембран вызывает изменение их структурно-функциональных свойств.

Однако возможность стабилизации свойств мембран витамином Е при действии СЖК и лизофосфолипидов изучена недостаточно. Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение взаимодействия а-токоферола с СШК и лизофосфолипидами как одного из возможных механизмов биологического действия витамина Е.

Для достижения данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить механизмы взаимодействия а-токоферола с СЖК и лизофосфолипидами в органических растворах;

2. Исследовать стабилизацию физических свойств модельных фосфолипидных мембран а-токоферолом при действии СЖК;

3. Уточнить локализацию а-токоферола в липидном бислое;

4. Оценить возможность стабилизации структурно-функциональных свойств мембран синаптосом при действии СЖК и фосфолипазы А_. Научная новизна

В работе впервые с использованием методов ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, парамагнитных и флуоресцентных зондов, спектрофлуорометрии исследованы механизмы взаимодействия а-токоферола со свободными жирными кислотами и лизофосфолипидами, а также влияние этого взаимодействия на физико-химические параметры искусственных и структурно-функциональные свойства биологических мембран. Обнаружено, что в растворе реализуются два типа взаимодействия между молекулами а-токоферола и СЖК: полярное взаимодействие ОН-группы хроманового ядра токоферола с С=0-группой СЖК и взаимодействие ацильных цепей СЖК с метильными группами хроманового ядра а-токоферола. Последнее взаимодействие резко усиливается при увеличении числа двойных связей в молекуле СЖК и проявляется в ограничении молекулярной подвижности молекулы токоферола. В растворе аналогичное взаимодействие наблюдается между СЖК и пентаметилхроманом, в котором фитольная цепь замещена на метильную группу, а также с синтетическим антиоксидантом ионолом. Установлено, что взаимодействие реализуется также между токоферолом и такими продуктами фосфолипазного гидролиза как фосфатидная кислота и лизофосфатидилхолин.

Методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения с использованием парамагнитных сигнал-сдвигающих реагентов уточнена оценка топографии токоферола в фосфолипидном бислое. Показано,

что хромановое ядро а-токоферола локализовано в области глицериновых остовов фосфолипидов.

Методом H^X-HMP спектроскопии высокого разрешения и ЭПР-спинового зондирования продемонстрирована способность а-токоферола оказывать холестериноподобное действие на физическое состояние бислоя - упорядочивать ненасыщенные и разупорядочивать насыщенные фосфолипидные бислои. С использованием регистрации потенциал-зависимой флуоресценции (ПЗФ) зонда 3,3'-дипропил-2,2'-тиодикарбоцианина (diS-C₃(5)) установлено, что в отличие от пентаметилхромана и ионола о-токоферол способен стабилизировать трансмембранный потенциал мембран синаптосом от деполяризующего действия фосфолипазы А₂ и СЖК.

Обнаружена повышенная чувствительность синаптосом, изолированных из мозга Е-дефицитных крыс, к деполяризующему действию СЯК. Продемонстрирована способность экзогенного а-токоферола восстанавливать чувствительность синаптосом к действию СЖК. Научно-практическая значимость

Полученные результаты расширяют представление о молекулярных механизмах, обеспечивающих биологическое действие витамина Е. Данные, указывающие на возможность стабилизации структурно-функциональных свойств нейрональных мембран при действии фосфолипазы А₂ и продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазои (\₂, позволяют рассматривать возможность использования витамина Е цля преодоления патологических состояний мозга, сопровождающихся аномалиями липидного обмена. Апробация диссертации

Результаты работы докладывались на I Всесоюзной конференции "Принципы и механизмы деятельности мозга человека" (Ленинград, 1985), симпозиуме "Drug metabolizing enzyme systems" (Sofia, 1986), межинститутской конференции Института экспериментальной кардиологии и Института клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ЗКНЦ АМН СССР (Москва, 1987) и на V Всесоюзном семинаре "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Рига, 1988). "Io материалам дисертации опубликовано 13 научных работ, получено авторское свидетельство.

Рбъем и структура работы Диссертация изложена на 127 страницах, зключая 29 рисунков, 6 таблиц и список цитируемой литературы (127 істочников). Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и зыводов.