Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Исследование процессов трансформации внешних сигналов физической или химической природы в биологический эффект в клетке (сигнальной трансдукции) является актуальной задачей современной биофизики. Хорошо известно, что в ряде сигнальных путей, идентифицированных в клетках животных, роль медиаторов играют циклические мононуклеотиды (цГМФ, цАМФ), продукты метаболизма фосфолипидов, ионы кальция и другие соединения.
До недавнего времени о процессах трансдукции в растениях было известно гораздо меньше по сравнению с животными. Только за последнее десятилетие наметился значительный прогресс в понимании механизмов трансформации сигналов в растительных клетках. Так, было показано, что Са2+ и система фосфоинозитидов участвуют в различных процессах внутриклеточной сигнализации также и в растениях. Однако получены только косвенные доказательства сигнальной роли циклических мононуклеотидов в растительной клетке, базирующиеся на её функциональных ответах. Поэтому на фоне явного прогресса в исследованиях процессов трансдукции в растительной клетке, многое остается еще неясным.
К началу выполнения работы не было никаких данных о взаимосвязи различных сигнальных путей трансдукции в растительной клетке с участием ионов кальция и циклических мононуклеотидов. Более того, оставался открытым вопрос о присутствии и физиологической роли в растениях циклических мононуклеотидов и, в первую очередь, цАМФ, а также функционировании системы его метаболизма.
Таким образом, представлялось важным исследовать взаимодействие между различными сигнальными системами, в частности, системами Са2+, цАМФ и цГМФ. Кроме того, необходимо было попытаться установить и возможное участие в процессах трансдукции системы цАМФ - давно и хорошо охарактеризованной в клетках животных и совершенно не исследованной в растительной клетке.
Связь работы с научными программами.
Диссертационная работа выполнялась в рамках Государственной программы фундаментальных исследований по теме «Исследования промежуточных стадий процессов трансдукции световых сигналов в клетке» № 1996294 (1996-1998 гг.) и гранта Белорусского Республиканского Фонда Фундаментальных Исследований "Роль вторичных медиаторов в регуляции концентрации Са2+, как узлового звена в трансдукции фитогормонального и светового сигналов в растительной клетке" № Б97-293 (1998 г.).
Цель п задачи исследования.
Целью данной работы было исследовать взаимодействие систем циклических мононуклеотидов (цАМФ и цГМФ) и Са2+ в процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке и разрешить вопрос о существовании
в растениях системы метаболизма цАМФ. Поставленная цель включала решение следующих задач:
Исследовать влияние цикломононуклеотидов на [Са2+]иит в протопластах трансгенного табака Nicotiana plumbaginifolia, экспрессирующего экворин (Са2+-чувствительный фотобелок).
Изучить влияние цАМФ и цГМФ на регулируемое фитохромом накопление ионов кальция протопластами овса Avena sativa.
Оценить эндогенную концентрацию цАМФ в тканях растений (овса и табака) и его возможное участие в трансдукции внешних сигналов.
Изучить основные характеристики аденилатциклазы - фермента, катализирующего синтез цАМФ.
Объект и предмет исследования
В качестве основного объекта использовались изолированные протопласты трансгенного табака Nicotiana plumbaginifolia и овса Avena sativa, а также изолированные фракции растительных клеток и экстракты растительной ткани. Предметом данной работы было изучение взаимодействия систем циклических мононуклеотидов (цАМФ и цГМФ) и Са2+ в процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке и исследование системы метаболизма цАМФ в растениях.
Гипотеза
Высказано предположение, что в растительной клетке функционирует система цАМФ, и одним из этапов трансдукции ряда внешних сигналов является взаимодействие сигнальных систем цикломононуклеотидов и Са2+.
Методология и методы проведенного исследования
Использовались радиоизотопные, радиоиммунологический и хемилю-минесцентный методы.
Научная новизна полученных результатов
Получены новые данные о влиянии дибутирильных и 8-бром аналогов цАМФ и цГМФ на [Са2+]аит в протопластах трансгенного табака, как в дефицитной среде, так и в присутствии этого иона во внешней среде. Впервые показано влияние модуляторов циклазных систем, изобутилметилксантина (IBMX), форсколина, 2',5'-дидеоксиаденозина (ДЦОА), запринаста на [Са2+]цвт растительной клетки. На основании полученных данных сделан вывод о том, что рост [Са2+]цит под влиянием цикломононуклеотидов обусловлен выходом иона из внутриклеточных кальциевых депо и сопряжен с физиологическими процессами. Установлено, что Са2+-каналы являются транспортными системами, чувствительными к действию циклических мононуклеотидов.
Установлено, что растительная клетка характеризуется вполне реальным содержанием цАМФ, который может участвовать в процессах внутриклеточной сигнализации в качестве вторичного посредника. Обнаружено влияние облучения красным и дальним красным светом на эндогенную концентрацию цАМФ в растениях, а также взаимозаменяемость влияния красного света и циклических мононуклеотидов на накопление Са2+ протопластами овса.
Полученные данные также позволяют сделать вывод о наличии в клетках проростков овса мембран-связашюй формы аденилатциклазы. Активность фермента, определяемая при оптимальных условиях, составляет в среднем 2-4 пмоль / мг белка / мин., и активация осуществляется с участием ГТФ-связывающих белков.
Практическая значимость полученных результатов Полученные в ходе выполнения работы данные значительно расширяют существующие представления о процессах трансдукции ряда внешних сигналов в растительной клетке и могут быть использованы в курсах лекций по биофизике, фотобиологии, биохимии и физиологии растений. Внедрение метода хемилюминесцентного мониторинга уровня внутриклеточного кальция в дальнейшем позволит тестировать степень влияния различных факторов антропогенной природы, например, химических соединений, активно используемых в сельском хозяйстве (фунгициды, инсектициды, гербициды и т.д.) на растительный организм. Кроме того, изучение молекулярных механизмов трансдукции ряда сигналов, например, биологически активных соединений, фитогормонов и света в растительной клетке является важным для оптимизации процессов роста и развития растений в искусственных условиях. Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Мембран-проницаемые аналоги циклических мононуклеотидов и некоторые модуляторы активности циклазных систем вызывают рост цитоплаз-матической концентрации кальция в протопластах транс-генного табака.
-
Установлена взаимозаменяемость действия цАМФ, цГМФ и красного света на фитохром-зависимое накопление Са2+ протопластами овса.
-
Эндогенный уровень цАМФ в зеленых растениях является физиологически значимым и изменяется под влиянием красного и дальнего красного света. Определены основные характеристики аденилатциклазы в клетках овса.
Личный вклад соискателя
Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены при решающем участии автора.
Апробация результатов диссертации
Основные результаты работы были представлены на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пушино, 28-30 мая 1996 г.), II Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 25-27 июня 1997 г.), Школе-семинаре молодых ученых Федерации Европейских Биохимических Обществ "Использование одиночных клеток в изучении сигнальной трансдукции" (Лейден-Амстердам, Нидерланды, 3-Ю мая 1997г.), XIII Швейцарской конференции по методологии исследования рецепторов (Морчах, Швейцария, 3-7 мая 1998), III Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 21-23 октября, 1998)
Опубликованность результатов
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах и б тезисов докладов. Общее количество опубликованных страниц -21.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 5-ти глав, включающих обзор литературы; материалы, объекты и методы исследования; результаты исследования и их обсуждение; анализ и обобщение результатов исследования и заключение. Список цитируемой литературы включает 241 источник. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 1 таблицу.