Содержание к диссертации
Введение
1. Ионная асимметрия в живых системах 19
1.1. Механизмы поддержания ионного гомеостаза клетки 19
1.1.1. Na-насос 22
1.1.2. Взаимодействие мембраносвязанных белков 27
1.1.3. Роль конформационных изменений макромолекул в кинетике ферментативных реакций 39
1.2. Принцип параметрического разделения веществ и ионов 52
1.2.1. Микроскопическое рассмотрение. Молекулярная модель параметрического ионного насоса 53
1.2.2. Макроскопическая реализация параметрического насоса 59
2. Хиральная асимметрия в живых системах 71
2.1. Стереоизомеры биологически важных хиральных органических соединений 71
2.2. Гомохиральность белков и нуклеиновых кислот - необходимое условие матричного синтеза биополимеров 75
2.3. Роль D-аминокислот в обеспечении жизнедеятельности клеток и организмов 79
2.4. Физико-химические свойства энантиомеров аминокислот и сахаров82
2.5. Изменения структуры и функций полипептидов при замене остатков L-аминокислот на остатки D-аминокислот без изменения первичной структуры 83
3. Физико-химические свойства неравновесной границы раздела раствор-воздух 91
3.1. Формирование неравновесного тонкого поверхностного слоя на границе раздела раствор-воздух и его физические характеристики Фракционирование катионов в неравновесном тонком поверхностном слое раствора и устойчивость границы раздела раствор-воздух в сильных неоднородных электрических ПОЛЯХ 113
3.2.1. Экспериментальные исследования в лабораторных условиях 113
3.2.2. Модели перераспределения катионов между тонким поверхностным слоем и объемной фазой раствора с учетом диффузии и конвекции в гомогенной среде 118
3.2.3. Феноменологическая модель фракционирования катионов в тонком поверхностном слое раствора 130
3.4. Фракционирование энантиомеров хиральных соединений в неравновесном тонком поверхностном слое раствора 134
3.4.1. Фракционирование энантиомеров аминокислот при образовании аэрозоля 134
3.4.2. Исследование фракционирования энантиомеров аминокислот и Сахаров на границе раздела фаз методом генерации второй оптической гармоники 136
3.4.3. Фракционирование энантиомеров лейцина в неравновесном тонком поверхностном слое раствора при образовании пен 140
4. Физико-химические факторы предбиологической эволюции 144
4.1. Геофизические и геохимические процессы и условия на Земле на ранних стадиях ее эволюции 152
4.2. Абиогенный синтез биологически важных органических соединений 157
4.3. Ионная и хиральная асимметрии в моделях предбиологических систем 164
4.4. Спонтанное возникновение предшественников протоклеток на неравновесной границе раздела океан-атмосфера 172
5. Проблема хиральных загрязнений в экологической безопасности 175
5.1. Анторопогенные хиральные загрязнения 176
5.2. роль границы раздела океан-атмосфера в аккумуляции и Распространении загрязнений 192
5.3. Моделирование процессов очистки в двумерных экологических системах 196
Заключение. Необходимые и достаточные условия возникновения ионной и хиральной асимметрии в ходе предбиологической эволюции 203
Выводы 206
Литература 209
- Роль конформационных изменений макромолекул в кинетике ферментативных реакций
- Гомохиральность белков и нуклеиновых кислот - необходимое условие матричного синтеза биополимеров
- Фракционирование энантиомеров хиральных соединений в неравновесном тонком поверхностном слое раствора
- Спонтанное возникновение предшественников протоклеток на неравновесной границе раздела океан-атмосфера
Введение к работе
К одной из важнейших проблем теоретической биологии и биофизики относится происхождение жизни. Как и всякая глобальная проблема, она состоит из ряда частных проблем, без решения которых невозможно получить обоснованного ответа на основной вопрос: как появилась жизнь на Земле, или, другими словами, каким образом произошел переход от геохимической эволюции Земли к биохимической.
Среди частных проблем важнейшими на наш взгляд являются проблемы абиогенеза, т.е. синтеза органических соединений без участия организмов, а также возникновения дискретных предшественников клеток, или пробионтов, обладавших основными их свойствами. К таким основным свойствам относятся относительное постоянство внутренней среды и существенное отличие ее состава от состава окружающей среды, способности к реагированию на изменения внешней среды, перемещению, самовоспроизведению. Указанные свойства обусловлены разнообразными процессами, происходящими на границе раздела между пробионтом и окружающей средой. Следовательно, эта граница раздела - наружная мембрана пробионта - должна была обладать структурой и свойствами, обеспечивающими возможность выполнения необходимых для существования пробионта функций. О том, какими могли быть структура и свойства мембран пробионтов и как возникли первичные мембранные структуры можно судить лишь по косвенным данным, опираясь, в основном, на принцип актуализма.
Эволюция предшественников клеток привела к появлению современных организмов, обладающих многими признаками, которых не было у их примитивных предков. С точки зрения физики такой процесс связан с увеличением содержания доступной для нас информации в эволюционирующей системе [1, 2, 3, 14]. В то же время, возникает вопрос, связано ли наблюдаемое увеличение количества информации с созданием новой информации или же с выявлением скрытой информации [4]. В последнем случае возникновение новых признаков предопределено физико-химическими свойствами эволюционирующей системы, т.е. система определенного типа, будучи проведена через последовательность одних и тех же внешних условий, в большинстве случаев приобретет вполне определенный набор признаков. Возможность предсказания этих признаков зависит от понимания сути процессов, приводящих к изменениям компонентов системы, поэтому в отношении более или менее сложных систем существует не всегда.
Во всех случаях изменение количества информации в системе связано с процессами запоминания [4, 13, 14]. Эти процессы могут реализоваться с помощью разных носителей информации и поэтому имеют разную точность. Конечная точность запоминания, особенно у пробионтов, приводит к тому, что вместо строго определенного набора признаков в системе возникают распределения наборов признаков - возникает квазивид [8]. В ходе эволюции квазивида изменялась и точность запоминания. Дрейф квазивида в виртуальном пространстве признаков происходит под действием условий окружающей среды. Выживание особей определяется их селективными преимуществами перед другими особями, а сами селективные преимущества - возможностью протекания и интенсивностью физико-химических процессов, обусловливающих жизнедеятельность особи, и возможностью воспроизведения их у потомства (запоминания). Таким образом, выявление факторов селективного преимущества и механизмов их действия в предбиологических системах на разных стадиях эволюции позволяет ответить и на вопрос о природе изменения количества информации в ходе эволюции.
Поскольку естественный отбор в современных популяциях осуществляется на уровне фенотипа, а запоминание - на уровне генотипа, возникает вопрос о механизмах такой двусторонней связи. Исторически сложились два, обычно противопоставляемых, подхода к его решению -дарвинизм и ламаркизм. Здесь мы отметим только, что полученные за последние годы данные в области молекулярной биологии позволяют согласовать оба эти подхода между собой: второй (гистоновый) генетический код, регулирующий экспрессию генома, изменяется в зависимости от факторов окружающей среды [9,10].
До возникновения генетического кода пробионтам при размножении приходилось более или менее точно воспроизводить все свои структуры, а не только их коды. Поскольку факторы среды обитания непосредственно влияли на эти структуры, не было проблемы с кодированием этого влияния, и приобретенные пробионтом признаки непосредственно передавались потомству. В некотором смысле ламаркизм и дарвинизм по отношению к предбиологическим системам приводят к одинаковым следствиям.
Эволюция предбиологических систем описывается общими закономерностями эволюции сложных иерархических систем. Для того чтобы эволюция системы дискретных элементов могла приводить к возникновению других систем с отличными от исходных элементами, необходимо, чтобы ее элементы системы обладали следующими свойствами [8,15]:
-изменчивостью (элементы системы отличаются друг от друга по свойствам);
-способностью к конвариантному самовоспроизведению (потомки не обязательно являются точными копиями родителей);
-определенной, хотя и неодинаковой, продолжительностью жизни и интегральной продуктивностью (т.е. способностью оставлять разное количество потомков, имеющих разную продуктивность);
-индивидуальным селективным преимуществом (эффективностью использования ресурсов, шириной нормы реакции гомеостаза, которые конвариантно воспроизводятся в потомстве).
Применение перечисленных выше принципов дарвиновской эволюции к предбиологическим системам позволило получить весьма продуктивные модели гиперциклов, сайзеров и квазивидов [8, 11], позволившие определить необходимые условия возникновения пробионтов.
В традиционной теории эволюции предполагается, что биоразнообразие изменяется за счет выживания организмов, наиболее адаптированных к изменяющимся условиям окружающей среды, а хуже адаптированные организмы вымирают. Тогда на филогенетических деревьях, отражающих этот процесс, современному состоянию биосферы должны соответствовать только самые верхние ветви, а несущие их более крупные ветви должны были бы соответствовать вымершим организмам. На самом деле биота представлена всеми основными группами организмов, когда-либо существовавших на Земле [5, 6], и эволюция основана на отборе организмов с уже сформировавшимися признаками, предоставляющими их обладателям какие-то селективные преимущества по сравнению с другими сходными организмами. Так, одни из первых организмов, появившихся на Земле более 2,5 млрд лет назад, цианобактерии, прекрасно чувствуют себя в современных условиях и не вымирают, несмотря на то, что окружены гораздо более «высокоразвитыми» видами. Это один из парадоксов, возникающих при упрощенном применении принципов дарвиновской эволюции к естественным системам.
Эволюция иерархических систем происходит, по-видимому, по общим для всех таких систем законам [12, 13]. Эволюционные изменения высших уровней системы представляют собой различные комбинации изменений ее низших уровней, которые происходят более или менее автономно. При этом, конечно, надо учитывать характерные времена тех или иных изменений, как на отдельных уровнях системы, так и во внешних условиях. Предбиологическая эволюция является одним из компонентов эволюции Земли, а вместе с ней - эволюции солнечной системы, галактики, вселенной. Комбинаторный принцип образования новых элементов эволюционирующих систем прослеживается на всех ярусах эволюции вселенной, от элементарных частиц до скоплений галактик [16-19]. Это приводит к тому, что компоненты вновь образующихся систем наследуют многие характеристики предковых форм соответствующих уровней, что служит некоторым оправданием принципа актуализма.
Следуя этой логике, мы можем предположить, что свойства, общие для наружных мембран всех современных клеток, должны были в той или иной степени проявляться и у их предшественников. Таким образом, исследование универсальных свойств и функций мембран современных клеток необходимо для понимания того, какими должны были быть мембраны пробионтов.
Для решения проблем, связанных с возникновением предшественников клеток, обладавших наблюдаемыми в настоящее время у их потомков наиболее общими свойствами - неравновесностью, определенным ионным составом, хиральной чистотой белков, Сахаров и липидов, аппаратом конвариантного матричного синтеза, способностью к самовоспроизведению, возбудимостью и подвижностью - необходимо согласование двух подходов: экстраполяции свойств известных неравновесных систем на все более сложные иерархические системы и реконструкции возможного пути эволюции наиболее простых живых систем и их подсистем. При движении «снизу», т.е. от геохимических систем к биохимическим, необходимо выяснить, какие именно системы обладали свойствами, достаточными для возникновения предшественников клеток, а при движении «сверху» - какие свойства систем были необходимы для реализации того или иного пути эволюции пробионтов. Таким образом, могут быть получены необходимые и достаточные условия возникновения предшественников клеток.
Для всех живых клеток характерно неравномерное и неравновесное распределение веществ и ионов между клеткой и окружающей средой. Среди этих распределений особое место занимают распределения неорганических катионов - натрия, калия, кальция и магния - и энантиомеров хиральных соединений - аминокислот и Сахаров. Ввиду общности характера этих распределений для всех живых клеток, их следует считать двумя фундаментальными асимметриями в живых системах - ионной и хиральной. Всеобщность ионной и хиральной асимметрий порождает вопрос об их возникновении - возникли ли они в ходе биологической эволюции, или их возникновение было предопределено физико-химическими факторами предбиологической эволюции.
В клетках существуют специальные механизмы обеспечения ионной и хиральной асимметрий. Изучение их структурной организации и физических принципов функционирования позволяет сформулировать минимальные требования к таким механизмам, выявить факторы селективного преимущества у систем, которые могли участвовать в предбиологической эволюции, а также необходимые условия для возникновения этих систем -предшественников клеток.
Предлагавшиеся механизмы возникновения асимметричных распределений ионов и энантиомеров аминокислот и Сахаров либо содержали внутренние противоречия, либо были метафизическими и умозрительными, т.е. не были подтверждены хотя бы косвенными экспериментальными данными. В частности, наиболее распространенные представления о происхождении пробионтов основаны на свойствах равновесных гетерогенных термодинамических систем, в то время как живые клетки -существенно неравновесные системы.
Представление о том, что в ходе эволюции происходил не синтез новой информации, а реализация скрытой информации, уже содержащейся в системе, приводит к выводу о том, что в неживой природе должны быть системы, в которых, по крайней мере в принципе, могли бы наблюдаться явления и процессы, характерные для живых систем. При этом в ходе эволюции, химической, а затем и биологической, происходило «усиление» проявления свойств, обеспечивающих какие-либо селективные преимущества эволюционирующей системе, а механизмы усиления создавались в ходе той же эволюции из «предсуществующих» физико-химических механизмов1 соответствующих процессов. Тогда неживые системы, обладающие свойствами, сходными со свойствами живых систем, могли бы претендовать на роли предшественников живых систем.
Большинство важнейших процессов в клетках происходит на границах разделов фаз, чаще всего с участием липидных мембран. Но даже ферментативные реакции, которые иногда рассматривают как гомогенные каталитические реакции, на самом деле правильнее рассматривать как гетерогенные, протекающие на сложной границе раздела фаз белок-раствор. Это наводит на мысль, что клеточная биохимия сложилась в ходе предбиологической эволюции систем, включавших границы разделов фаз.
На ранних стадиях развития Земли фактором, в наибольшей степени ограничивавшим возможности возникновения жизни, была, по-видимому, высокая температура. Поэтому интересующий нас период относится ко времени, когда Земля уже достаточно остыла, чтобы произошла конденсация воды. Формирование земной коры также относится к этому периоду, поэтому обычно считается, что рельеф земной поверхности в то время был относительно выровненным.
Проблеме происхождения жизни в последние годы стали уделять все большее внимание различные научные организации. Это связано с тем, что поиски жизни на других планетах солнечной системы и вне ее стоят слишком дорого и необходимо как-то сузить область этих поисков. Так, например, в солнечной системе основными объектами исследования с последние годы стали Марс, Титан (спутник Сатурна) и Европа (спутник Юпитера). Вне солнечной системы обнаружено более 130 планетных систем, для исследования возможности существования разумной жизни на которых созданы специальные научные группы.
В 2006 г. Фонд исследования происхождения жизни (The Origin-of-Life Foundation, Inc.) объявил конкурс на лучшую гипотезу о спонтанном возникновении механизма передачи наследственной информации, достаточного для возникновения жизни. Победители конкурса будут получать по 50 тыс. долларов ежегодно в течение 20 лет. В тему конкурса входят гипотезы абиогенеза, самовоспроизведения, самоорганизации, возникновения пробионтов и протоклеток, проблемы гомохиральности, коэволюции и множество других частных задач, связанных с основной проблемой.
В стратегический план NASA (США) входят всего три миссии: исследование и защита Земли, исследование вселенной и поиски жизни, подготовка нового поколения исследователей. Один из проектов этой организации называется «Origins» и включает изучение проблемы происхождения жизни и поиски ее на других планетах.
Процессы, приведшие к возникновению ионной и хиральной асимметрий в ходе геохимической эволюции, идут и в современных условиях. Следствием этого является то, что некоторые вещества, в частности, не свойственные природным экосистемам, могут накапливаться в различных их частях и влиять на их устойчивость. Так, например, для антропогенных загрязнений экосистем антиподами естественных стереоизомеров хиральных веществ механизмы деградации обычно отсутствуют, что может приводить к их накоплению и переносу на значительные расстояния. Это - новая проблема, без эффективного решения которой возможны экологические кризисы с непредсказуемыми последствиями.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление и изучение физико-химических факторов, обусловивших возникновение ионной и хиральной асимметрий в ходе предбиологической эволюции и сохранение этих асимметрий в живых системах.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:
• исследование физико-химических механизмов поддержания ионного гомеостаза в живых системах, построение моделей одноионного канала и Na-насоса клеточных мембран;
• исследование роли внутримембранных взаимодействий и самоорганизации мембран в обеспечении ионного гомеостаза клетки;
• теоретическое описание кинетики ферментативной реакции с явным учетом медленных стадий конформационных перестроек фермента;
• разработка макроскопического аналога Na-насоса -параметрического насоса, осуществляющего разделение ионов натрия и калия в макроскопических системах;
• формирование общих представлений о гомохиральности белков и нуклеиновых кислот как основы сопряжения важнейших процессов жизнедеятельности клетки;
• выявление природных систем, в которых возможны процессы, приводящие к нарушению симметрии в распределении ионов и энантиомеров хиральных соединений между их подсистемами, и изучение их физических характеристик;
• изучение эффектов фракционирования ионов и энантиомеров хиральных соединений на неравновесных границах раствор-воздух (океан-атмосфера);
• теоретическое описание процессов фракционирования ионов и энантиомеров хиральных соединений в неравновесном тонком поверхностном слое раствора;
• развитие представлений об экологической безопасности с учетом природных процессов перераспределения ионов и энантиомеров хиральных соединений в гетерогенных системах.
Достоверность полученных результатов исследований и обоснованность положений, выводов и рекомендаций подтверждается адекватностью использованных экспериментальных подходов и методик, соответствием следствий теоретических описаний наблюдаемым в экспериментах и естественных условиях явлениям и процессам.
Научная новизна теоретических подходов и полученных результатов состоит в следующем.
Впервые в едином рассмотрении выполнено теоретическое и экспериментальное исследование физико-химических факторов, обусловивших возникновение двух фундаментальных асимметрий в живых системах - хиральной (аминокислоты, углеводы, липиды) и ионной - в ходе предбиологической эволюции.
Предложена, разработана и экспериментально обоснована новая гипотеза, касающаяся происхождения жизни на Земле, согласно которой возникновение исходно термодинамически неравновесных дискретных предшественников живых клеток обусловлено физико-химическими процессами в неравновесном тонком поверхностном слое мирового океана, образующемся в результате тепломассообмена между океаном и атмосферой. Экспериментально показано, что повышение концентраций солей в неравновесном тонком поверхностном слое раствора сопровождается изменением их относительных концентраций (фракционированием): поверхностный слой обогащается ионами калия и кальция относительно ионов натрия и магния, а также одним из энантиомеров рацемической смеси аминокислот или Сахаров.
Впервые показано, что устойчивость границы раздела раствор-воздух в сильных неоднородных электрических полях коррелирует с величинами энтальпии гидратации катионов. На основании изучения характеристик разряда между воздушным электродом и поверхностью раствора в различных условиях предложена феноменологическая модель фракционирования ионов в неравновесном тонком поверхностном слое раствора.
Показано, что при наличии на поверхности морской воды монослоя амфифильных молекул, например, липидов, разрушение воздушных пузырей у поверхности воды приводит к образованию аэрозольных капель, покрытых слоем амфифила и содержащих компоненты раствора, сконцентрированные в тонком поверхностном слое океана. Таким образом могли возникнуть предшественники клетки с асимметричным и неравновесным распределением катионов между внутренней и внешней средами, а также хиральной поляризацией состава аминокислот и углеводов. Обнаружено сопряжение процессов перераспределения катионов натрия и калия и энантиомеров аминокислоты (лейцина) в неравновесном тонком поверхностном слое раствора. Общность механизмов и сопряжение процессов перераспределения ионов и энантиомеров хиральных веществ в тонком поверхностном слое раствора предопределила ионный состав и хиральную поляризацию внутренней среды предшественников клеток, образовавшихся на границе раздела океан-атмосфера, и в ходе предбиологической эволюции привела к общим для всех живых систем ионной и хиральной асимметриям. С использованием кинетической модели Франка, описывающей спонтанное нарушение хиральной симметрии в химических реакциях, показано, что эффекты хиральной поляризации в тонком поверхностном слое достаточны для формирования хирально чистых предшественников клеток.
Совместно с коллективом исследователей разработан и экспериментально реализован новый метод изучения соотношения концентраций энантиомеров хиральных соединений (аминокислот и углеводов) в тонком поверхностном слое водного раствора по характеристикам второй оптической гармоники, генерируемой при отражении лазерного излучения от границ разделов фаз. С помощью этого метода показано, что энантиомеры аминокислот и углеводов неравномерно распределяются между тонким поверхностным слоем и объемной фазой раствора.
Предложена универсальная молекулярная модель ион-транспортных систем клеток - ионных насосов и каналов, позволяющая учесть влияние белково-липидных взаимодействий и флексоэлектрического эффекта, обусловленного деформацией липидного бислоя при конформационных перестройках мембраносвязанного белка. С использованием этой модели рассмотрено функционирование Na-насоса плазматических мембран клеток. Развита теория параметрического разделения ионов в модельных системах, а также параметрическая теория Na-насоса. В численных экспериментах продемонстрировано существенное изменение структуры и ионной специфичности мембранных каналов при полной замене L-аминокислотных остатков на их D-энантиомеры.
Развита модель Дещеревского-Сидоренко, описывающая кинетику реакций с учетом медленных конформационных изменений ферментов. Полученное уравнение для скорости реакции позволяет описывать практически все типы ферментативных реакций (в пределе это уравнение сводится к эмпирическому уравнению Каменского-Подрабинека) и учитывать влияние на скорость реакции различных внешних воздействий. Развиты новые представления о хиральной безопасности биосферы. Биосфера сталкивается с мощным потоком хиральных соединений, формируемым химической, перерабатывающей, фармацевтической, аграрной, пищевой промышленностью. Эффективное использование одних энантиомеров в медицине или агрокомплексе сопровождается токсическим и даже мутагенным действием их зеркальных энантиоморфов. Отсутствие системы глобального биосферного мониторинга и регламентирующих норм ПДК для хиральных соединений, не утилизируемых биосферой или промышленностью, в условиях антропогенного пресса приводит к их неконтролируемому накоплению в окружающей среде и может иметь непредсказуемые последствия.
Предложена нелинейная математическая модель утилизации хиральных соединений бактериями в поверхностном водном слое, выявляющая автоволновой режим работы «двумерного реактора» и позволяющая в перспективе управлять процессом утилизации поллютанта.
Практическая значимость работы. Теоретические и экспериментальные результаты работы могут найти практическое применение в следующих областях:
• при разработке новых методов диагностики поверхности океана;
• при изучении механизмов воздействия различных физико-химических факторов на биологические системы, в частности, при выяснении особенностей действия хиральных фармакологических препаратов, инсектицидов и гербицидов и при их разработке;
• при разработке методов разделения смесей веществ;
• при разработке новых методов очистки окружающей среды от антропогенных загрязнений;
• при разработке норм экологической безопасности с учетом перераспределения антропогенных хиральных загрязнений биосферы;
а также как материалы в курсах лекций по биофизике, биохимии, молекулярной биологии, фармакологии, экологии для студентов соответствующих специальностей. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Ионная и хиральная асимметрии биологических систем возникли в ходе предбиологической эволюции при формировании предшественников клеток в результате общих процессов на неравновесных границах разделов фаз океан-атмосфера-литосфера.
2. Формирование бислойных липидных мембран у пробионтов обеспечило необходимое разделение фаз и образование дискретных элементов эволюционирующих предбиологических систем, а также возникновение дополнительных факторов селективного преимущества, обусловленных электро-механо-химическим сопряжением неравновесных процессов в мембранах, которые в ходе эволюции привели к формированию систем обеспечения гомеостаза у современных клеток.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 82 печатные работы, из них в рецензируемых журналах по списку ВАК 20, в международных рецензируемых журналах 5, монография 1, статьи в других журналах, изданиях и тематических сборниках 21, в материалах конференций 35.
Роль конформационных изменений макромолекул в кинетике ферментативных реакций
Уже давно установлено, что конформационные изменения макромолекулы белка, сопровождающие ее быстрые локальные химические возмущения (присоединение лиганда к активному центру, его диссоциация, окислительно-восстановительные превращения ионов металлов переменной валентности в простетической группе, ионизация кислотных остатков) могут длиться 10"6—10-1 с, а иногда и дольше [3, 26, 34, 35, 40, 66, 70]. Есть также данные о возможности циклических изменений конформации фермента в некоторых процессах [79-81].
Рассмотрение этих явлений приводит к следующим двум физическим проблемам. Во-первых, в как происходят такие медленные процессы в молекулах, в которых собственные колебания атомов и атомных групп происходят с частотами на много порядков более высокими. Во-вторых, каким образом сохраняется экспериментально наблюдаемая синхронность конформационных изменений в ансамблях макромолекул.
В работе [82] предложен подход к решению этих проблем и проведено численное моделирование поведения ансамбля макромолекул при различных параметрах конформационной релаксации.
Расчет времени релаксации макромолекулы, представляемой в виде совокупности относительно жестких элементов конструкции, погруженных в вязкую среду и движущихся в результате электростатических взаимодействий, на основе классической гидродинамики и электростатики приводит к следующей оценке для времени релаксации: г вщґє/е2, где ц -вязкость среды, е-ее диэлектрическая проницаемость, /-расстояние, на которое перемещается группа с зарядом е в ходе релаксации (характерный размер группы также принят равным /). Для любых разумных значений этих параметров время релаксации не превышает 10-7 с, что слишком мало по сравнению с экспериментально наблюдаемыми значениями.
Такие расхождения связаны с использованием гидродинамического подхода, в котором профиль потенциальной энергии частицы при движении в вязкой среде монотонный (или потенциальные барьеры много меньше кТ). Согласование с экспериментом можно достичь, полагая, что конформационная релаксация соответствует движению через систему потенциальных барьеров. В случае одного барьера величина т увеличится пропорционально множителю гЩкт, где АЕ - высота барьера. Тогда для барьера высотой 15-20 кТ получатся значения времени релаксации, соответствующие экспериментальным данным.
Однако такое предположение приводит к затруднению с объяснением относительно долгой синхронизации состояний макромолекул в ансамбле после быстрого возмущения, например, в экспериментах по быстрому добавлению лигандов или субстрата к раствору фермента. Можно предполагать, что, начиная конформационную релаксацию из одного и того же состояния, молекулы ансамбля после прохождения 1-2 барьеров окажутся в разных состояниях, т.е. макроскопически это должно проявиться как быстрое затухание измеряемого сигнала, что не соответствует экспериментальным данным [79-81].
Рассмотрим упрощенную идеализированную ситуацию, когда релаксацию макромолекулы можно описать в виде движения некой виртуальной частицы по обобщенной конформационной координате х через систему многих потенциальных барьеров примерно одинаковой высоты, расположенных через равные интервалы Ах. При этом удобно считать, что 0 лг оо, т.е. циклы изменений конформационной координаты расположены вдоль одной оси последовательно друг за другом. Обозначим п(х) число молекул в минимуме потенциальной энергии, находящемся в точке х, и будем считать, что эффективно нет переходов обратном направлении. Тогда: где Р(х) - вероятность ухода молекулы из минимума потенциальной энергии в точке х (средняя частота переходов через барьер). Поскольку все барьеры одинаковы и их много, можно положить, что Р = const. Для нахождения решения полученного уравнения, разложим формально п(х) в ряд и ограничимся членами до второго порядка включительно. Тогда уравнение примет вид:
Начальные условия остаются, вообще говоря, неопределенными, но можно считать, что на малых временах п(х) является быстро убывающей X функцией. Перейдем к безразмерной координате v = —. Тогда решение можно записать в следующем виде: где N - полное число молекул в ансамбле. Пусть полное число барьеров, преодолеваемых макромолекулой в ходе релаксации в одном цикле, равно q. Если синхронизация конформационных состояний макромолекул в ансамбле исчезает через время to, то должно выполняться соотношение: n{v±q,t0) n(v,t0). Отсюда следует, что - —«1. 4г70 Число циклов т, совершенных в среднем макромолекулой до нарушения синхронизации, равно отношению полного числа барьеров, преодоленных Pi макромолекулой за время t0, к числу барьеров в одном цикле: ю«—-, Ч Следовательно, число потенциальных барьеров в цикле связано с числом циклов соотношением q 4m. Численное моделирование ансамбля релаксирующих макромолекул было проведено при более общих допущениях. Будем считать теперь, что \v q, причем уровни свободной энергии Гиббса G понижаются с ростом v с постоянным декрементом AGV=AG. Цикличность конформационных изменений учтем условием G(v+q) = G(v), причем AGq-»AG+Ea и Eaq = Ea= const., где Еа-высота потенциального барьера, и не будем ограничиваться только переходами в сторону увеличения v: Av = 0,±l (переход из состояния 1 в состояние q запрещен). Предположим также, что состояние ансамбля можно регистрировать по некоему сигналу A(t), измеряемому в состояниях молекулы вблизи q/2. Выражения «уровень свободной энергии Гиббса» и высота потенциального барьера использованы только как указания на способ расчета вероятностей переходов и другого конкретного смысла здесь не имеют. Вероятность перехода v- v+\ равна Р = ехр(-а„), а вероятность обратного перехода равна Р = ехр(-аи.1-АС). При этом предполагается, что в каждом состоянии мгновенно устанавливается тепловое равновесие с термостатом и, соответственно, больцмановское распределение по энергиям.
Гомохиральность белков и нуклеиновых кислот - необходимое условие матричного синтеза биополимеров
Все белки, получаемые в результате синтеза на рибосомах, построены из L-аминокислот, а все молекулы РНК и ДНК содержат в своем составе-только D-рибозу и D-дезоксирибозу, соответственно. Такая «хиральная чистота» биосферы вызывает два вопроса: во-первых, как она возникла, т.е. какие селективные преимущества давала обладавшим ею пробионтам или клеткам, и, во-вторых, как был выбран тип хиральности этих двух типов биологически важных соединений - случайно или не случайно, а как следствие каких-то физико-химических процессов. Древнейшие организмы - цианобактерии и другие прокариоты - уже имели все основные черты современных организмов и за последние 3 млрд лет они практически не изменились [5, 6, 102]. Следовательно, переход к гомохиральности наблюдаемого в наше время типа произошел довольно быстро и, возможно, имел характер фазового перехода (бифуркации). Рассмотрим два поставленных выше вопроса последовательно. Хотя телеологический подход к физико-химическим системам, каковыми являются клетки и доклеточные образования, не правомерен, но в биологии он может быть оправдан наглядностью и удобством интерпретации данных [4, 40]. Тогда первый вопрос можно переформулировать так: зачем живым системам (или их предшественникам) нужна гомохиральность.
Гомохиральны полимеры - белки и нуклеиновые кислоты, которые связаны процессом матричного самовоспроизведения (гомохиральность липидов, по-видимому, вторична и явилась следствием возникновения гомохиральных белков и нуклеиновых кислот). Гомохиральные полимеры обладают пониженной по сравнению с гетерохиральными макромолекулами с таким же числом мономерных звеньев энтропией, поэтому не могут быть термодинамически равновесными структурами. Следовательно, возникновение гомохиральности обусловлено особенностями кинетики процессов матричного синтеза. Последовательность гомохиральной нуклеиновой кислоты «вырождена» по типу (аденин, гуанин, тимин, урацил) основания: если основания одного типа поменять местами, то структура цепи не изменится. Это означает, что различные способы синтеза цепи, при которых меняется лишь порядок присоединения одноименных звеньев, будут приводить к одному и тому же конечному результату. Полное число гомохиральных цепей нуклеиновых кислот, содержащих noN оснований, равно 4N, а гетерохиральных - 8N, т.е. из N нуклеотидов можно составить в 2N раз больше гетерохиральных цепей, чем гомохиральных. Число различных гомохиральных цепей из N оснований, дм среди которых Nj оснований относятся к типу і (і = 1,2,3,4), равно 4 , а для гетерохиральной цепи это число равно ——j1—, где индекс] обозначает хиральность элемента цепи. Положив, что в гомохиральной цепи для любого і величина Nj равна N/4, а в гетерохиральной цепи, дополнительно, половина звеньев типа і имеет другую хиральность. Тогда числа различающихся гетеро- и гомохиральных Смысл этой оценки в том, что число различных гетерохиральных последовательностей нуклеотидов значительно превышает число гомохиральных последовательностей той же длины. Поскольку вероятность мутации пропорциональна отношению числу последовательностей данного типа (гомо- или гетерохиральных) к числу всех последовательностей заданной длины, гомохиральные последовательности должны быть гораздо устойчивее к мутациям. С другой стороны, образование комплементарной последовательности нуклеиновых оснований по гетерохиральной матрице без участия ферментов, по-видимому, невозможно, так как при замене какого-либо звена в гомохиральной нуклеиновой кислоте его зеркальным антиподом соответствующее основание оказывается повернутым примерно на 100 относительно нормального положения. Это полностью блокирует образование двойной спирали ДНК со спаренными основаниями. Таким образом, при использовании гетерохиральных матриц пришлось бы довольствоваться однонитевыми полимерами, которые значительно менее стабильны, чем двойная спираль ДНК. Кроме того, пришлось бы принимать меры, чтобы гомохиральные участки не «зарастали» комплементарными основаниями, не образовывали шпильки или другие вторичные структуры. Все это привело бы к значительному усложнению механизма матричного синтеза, потребовало бы дополнительных ресурсов и как следствие, сделало бы его менее «кинетически совершенным» [105]. Энтропия гомохиральной цепи меньше энтропии гетерохиральной на kN\n(xL\nxL +х01пл;0) где к- константа Больцмана, а х; - доля молекул і-го энантиомера в цепи (AS = кМїй при xL = Хд). Поэтому с термодинамической точки зрения гомохиральные цепи должны со временем превратиться в гетерохиральные. Однако из-за низкой скорости рацемизации при физиологических температурах это время очень велико. Таким образом, использование в живых системах автокаталитической реакции - матричного синтеза белков и нуклеиновых кислот - в качестве основы для самовоспроизведения накладывает ограничения на возможность участия в ней гетерохиральных нуклеиновых кислот. Кроме того, гетерохиральные нуклеиновые кислоты оказываются менее стабильными в водных растворах, чем гомохиральные [106].
Фракционирование энантиомеров хиральных соединений в неравновесном тонком поверхностном слое раствора
Для проверки возможности фракционирования энантиомеров аминокислот в неравновесном ТПС был использован метод исследования, основанный на корреляции составов ТПС и аэрозоля, образующегося при разрушении воздушных пузырьков у поверхности раствора [141]. С помощью этого метода возможно получение образцов раствора ТПС толщиной 10-20мкм[135]. Удельные оптические активности растворов L- и D-изомеров одинаковы по модулю, но противоположны по знаку, поэтому рацемический раствор не вращает плоскость поляризации света. В качестве меры нарушения симметрии распределения энантиомеров хирального соединения С -С в системе используют хиральную поляризацию TJ = ——-, где Q и Со концентрации L- и D-изомеров соединения. Методика эксперимента была такой же, как при определении изменений ионного состава ТПС.
В работе использовали рацемические водные растворы аминокислот аланина, валина, лейцина и глутамина с концентрацией 10-60 г/л и начальной хиральной поляризацией не более 0,1%. При барботировании поверхности раствора пузырьками воздуха диаметром около 8 мм образовывался аэрозоль, захватывающий ТПС толщиной не более 20мкм. Аэрозоль собирали с помощью вакуумного насоса на ядерный лавсановый фильтр с апертурой отверстий ОД мкм. После экстрагирования аминокислот дистиллированной водой, соотношение концентраций энантиомеров (хиральную поляризацию) определяли по оптической активности раствора, измеренной на поляриметре Prkin-Elmer241 МС при длинах волн 360, 407, 436 и 579 нм. В контрольных экспериментах установлено, что растворы не содержали оптически активных примесей помимо аминокислот. Результаты экспериментов по определению фракционирования энантиомеров аминокислот при формировании аэрозоля приведены на рис. 3.26. поляризация рассчитана по изменениям оптической активности смеси аминокислот в аэрозолях, полученных при барботировании водных растворов аминокислот (лейцин и глутамин - 20 г/л, валин 60 г/л) пузырьками воздуха диаметром 7-8 мм с частотой 1 с-1 при разности температур между объемной фазой раствора и воздухом 5 К. Результаты этих экспериментов, несмотря на значительный разброс, позволяют говорить, что в неравновесном ТПС раствора относительная концентрация L-изомеров использованных в экспериментах аминокислот выше, чем концентрация D-изомеров. Надо отметить, что концентрации аминокислот в объемной фазе очень высоки, близки к насыщающим. Поэтому в ТПС могли, возможно, реализоваться условия при которых возникала поверхностная кристаллизация аминокислот, при которой возможно нарушение хиральной симметерии системы [103].
Однако постоянство знака хиральной поляризации аэрозоля свидетельствует о наличии какого-то фактора преимущества для L-изомеров. На кафедре физики волновых процессов физического факультета МГУ был разработан новый чувствительный метод исследования распределения энантиомеров хиральных веществ на границах разделов фаз, основный на зависимости интенсивности второй оптической гармоники (ВГ) отраженного света от соотношения концентраций энантиомеров [142,143]. Особенностью данного метода является то, что основной вклад в полезный сигнал отраженной ВГ дает именно его поверхность, а не объем вещества. Поскольку эффективность поверхностной ВГ сильно зависит от состояния поверхности, ориентации адсорбированных молекул, поляризации падающего излучения, то анализ зависимости сигнала поверхностной ВГ от параметров падающего излучения позволяет получать полезную, а иногда и уникальную информацию об исследуемом образце. Сложностью метода генерации ВГ от границы воздух-жидкость является относительно слабый уровень полезного сигнала (интенсивность ВГ на 17(!) порядков ниже интенсивности первой гармоники). Для усиления полезного сигнала использованы поверхностные электромагнитные волны. С помощью этого метода нами совместно со с.н.с. кафедры общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ А.П. Шкуриновым и аспирантом кафедры биофизики М.Ш. Багини на базе кафедры ОФВП были исследованы границы растворов L- и D-энантиомеров, а также рацематов арабинозы и валина[144]. Эксперименты проведены в двух модификациях: при отражении от границы раздела кварц-раствор и при отражении от границы раздела раствор-воздух.
Схемы кювет для исследования оптических свойств ВГ, генерируемой при отражении от поверхности изотропного раствора хиральных молекул В наших экспериментах раствор хирального вещества помещали в специально изготовленные кюветы (рис. 3.27). В одной из них поляризованный лазерный луч проходил через кварц и отражался от закрытой границы раствор - кварц (А), в другой - проходил через раствор и отражался от открытой границы раствор - воздух (Б). Во втором случае реализована ситуация, моделирующая свободную поверхность Мирового Океана. Экспериментально исследованы границы растворов L и D энантиомеров, а также рацематов арабинозы и валина. В обоих типах кювет фиксировалось присутствие энантиомеров на границе раздела фаз (метод чувствителен не к присутствию оптически активного вещества в объемной фазе, а к его концентрации на границе раздела). При этом чувствительность метода существенно больше для кюветы с открытой поверхностью.
Спонтанное возникновение предшественников протоклеток на неравновесной границе раздела океан-атмосфера
Выше было показано, что аэрозоль, образовавшийся при разрушении воздушных пузырьков на поверхности раствора, захватывает с собой компоненты ТПС раствора. При наличии в растворе аминокислот и углеводов на неравновесной границе раздела фаз возможно фракционирование ионов и энантиомеров, при котором ТПС и, следовательно, аэрозоль, обогащаются ионами калия, L-аминокислотами и D-сахарами. В работе [208] впервые сделано предположение о том, что морские аэрозоли могли играть роль в происхождении клеток. Основываясь на собственных данных, мы высказали гипотезу о возможной роли процессов на границе раздела океан-атмосфера, включая образование морских аэрозолей, в формировании предшественников клеток [209-211].
В ходе предбиологической эволюции пробионтам необходимо было выработать механизм защиты внутренней среды от перемешивания с окружающей средой, то есть должны были возникнуть дискретные элементы - объекты биологической эволюции. Существуют несколько механизмов образования мицелл и везикул из амфифильных молекул, но все они требуют довольно высоких концентраций липидов или других амфифилов и не приводят к ионной асимметрии состава везикул и окружающей среды (см., например, [205]).
Предположим, что поверхность раствора покрыта разреженным монослоем амфифильных молекул, например липидов. Тогда пленочные капли, в отличие от реактивных, также будут покрыты монослоем тех же молекул. Пока капли находятся в воздухе, они будут терять воду из-за ее испарения. При этом размеры капель будут уменьшаться, а монослой амфифила - уплотняться до тех пор, пока не станет достаточно плотным, чтобы испарение воды сильно замедлилось. Если такая, покрытая плотным монослоем липида капля падает обратно на поверхность раствора, она не утонет сразу, поскольку имеет сильно гидрофобную поверхность, и будет находиться на поверхности раствора, пока не покроется вторым слоем амфифила, обращенным гидрофильной стороной в раствор. Таким образом, формируется везикула, покрытая плотным бислоем амфифила и схожая с клеткой как размерами, так и тем, что ее состав не является равновесным по отношению к окружению. Последовательность стадий образования такой везикулы показана на рисунке 4.6.
Очевидно, что химический состав везикулы, или липосомы, сответствует химическому составу поверхностного микрослоя. Если микрослой содержал какие-либо абиогенно синтезированные органические соединения, они войдут и в состав липосомы. Таким образом, чтобы предлагаемая модель возникновения протоклетки была правдоподобной, необходимо, чтобы в природе существовал механизм, приводящий к фракционированию стереоизомеров аминокислот и Сахаров в поверхностном слое раствора, поскольку для живых систем характерна абсолютная хиральная чистота.
Позже эта гипотеза получила дальнейшее развитие [128, 212-216]. В частности была показана способность аэрозольных частиц к самопроизвольному асимметричному делению, причем дочерние частицы имеет размеры, характерные для клеток и вирусов.