Водообмен и системы переноса ионов у клеток в высших растениях Великанов, Геннадий Алексеевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Известно, что молекулы воды способны диффундировать через искусственные бислойные липидные мембраны. Вследствие этого БЛМ сравнительно хорошо проницаемы для воды. Нет никакого запрета на существование подобного диффузионно-растворительного механизма и для транспорта воды через естественные клеточные мембраны. Вместе с этим в мембранах клеток харовых водорослей уже давно (Collander, 1954) на основании опытов по проницаемости малых молекул неэлектролитов постулируется существование узких водных пор с размером, сравнимым с размером молекул воды, реализующих однорядный транспорт последних через мембрану. Совсем недавно методами молекулярно-генетического анализа установлено, что такие однорядные водные поры в мембранах многих растительных клеток имеют белковую природу. Идентифицированы гены, кодирующие эти белки - аквапорины (см. например, Steudle, Henzler, 1995). Определена их аминокислотная последовательность (первичная структура). Представлена топология аквапорина в мембране (Johansson et al., 1996). Однако реальный вклад каждого из двух названных «путей» в суммарный трансмембранный водообмен не оценен. Не установлено каковы возможности этих двух «путей» в регуляции проницаемости клеточных мембран для воды, каковы особенности их реакций на внешние воздействия и каковы их возможности в реализации водоудерясивающей способности живых клеток. В этой связи остается нерешенным также вопрос об участии транспортных «русел» селективных ионных каналов в обеспечении водопроницаемости клеточных мембран. Остается далеким от разрешения и такой специфический вопрос физиологии водообмена растительных клеток, как вопрос о роли систем трансмембранного переноса ионов в обеспечении поступления воды и вакуолизации растительных клеток при их росте растяжением и регуляции тургора клеток. Важный аспект нерешенных проблем водообмена у клеток в растениях связан также с отсутствием убедительного объяснения (теории) для механизма передвижения воды и ионов между клетками в корнях, обеспечивающего водона-гнетающую деятельность последних (отсутствие завершенной теории так называемого корневого давления или корневой экссудации). Существующие на этот счет гипотезы основьшаются на симпластической теории Арица (Arisz, 1956), в соответствии с которой все клетки корня считаются соединенными между собой высокопроницаемыми для воды и ионов плазмодесменнымн связями и образуют единую систему - симпласт, практически тождественную одной клетке. Роль плазмодесм при передвижении воды и ионов по симпласту вдоль радиуса корня сводится, таким образом, лишь к их роли в создании такой «единой клетки».

Симпласт считается электрически эквипотенциальным, в нем отсутствуют сколь-либо существенные градиенты для активности воды и ионов. При отсутствии надежной теории корневой экссудации изучение регуляторного влияния плазмодесм на транспорт воды и ионов между клетками в корне приобретает особую актуальность.

Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании механизмов транспорта воды через клеточные мембраны и механизмов регуляции водообмена у клеток в высших растениях в связи с функционированием систем трансмембранного переноса ионов и переносом ионов по плазмодесмам. Для этой цели последовательно были поставлены и решены следующие основные задачи исследования.

1. Предложена и обоснована простая методика применения метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля для оценки изменений диффузионной водопроницаемости клеточных мембран в корнях проростков высших растений (на примере проростков пшеницы) под воздействием внешних факторов.

2. Метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля применен для обнаружения нефиковского механизма диффузии молекул воды через естественные клеточные мембраны (транспорт воды по однорядным порам).

3. Исследовано в сопоставительном плане влияние мембрано-активных веществ (из набора таковых с различным механизмом действия: специфических мембранных каналоформеров, веществ «разрыхляющих» липидную фазу мембран и т.п.) на параметры водообмена корневых клеток в «осмотических» и «диффузионных» экспериментах (т.е. сопоставлены относительные (опыт - контроль) изменения выхода воды из клеток за фиксированный отрезок времени под влиянием градиента водного потенциала на мембране с соответствующими относительными изменениями показателя диффузионной проницаемости, полученными методом ЯМР, при отсутствии градиента водного потенциала на мембране). Задача такого сопоставления (сравнения) - найти феноменологический критерий для оценки перераспределения вкладов двух «путей» транспорта воды в общий трансмембранный водообмен под воздействием «регулирующего» фактора.

4. Проанализировано влияние реагентов на SH-грулпы белков, некоторых мембрано-активных вешеств и ингибиторов энергетического метаболизма на проницаемость клеточных мембран для воды.

5. Исследован феномен ауксининдуцированного набухания протопластов, изолированных из клеток высших растений. Найдены элементы специфичности такого набухания (поступления воды), связанные с функционированием систем трансмембранного переноса ионов. Исследована роль протонного насоса плаз-

малеммы в поступлении воды и в синтезе полисахаридов клеточной стенки, как составных элементов процесса роста клеток растяжением.

6. С задачей поиска новых подходов к изучению механизма вакуолизации растительных клеток и роли в этом процессе систем переноса ионов через тоно-пласт продемонстрировано наличие быстрого "захвата" вакуолью (или тонопла-стом) in situ избытка катионов цитоплазмы, возникающего при фиксации на локальном участке плазмалеммы изолированного из клетки высшего растения протопласта гиперполярнзующего скачка напряжения.

7. Получены и исследованы в сопоставительном плане данные по изменению эффективного коэффициента самодиффузии воды в корнях под влиянием физиологически-активных веществ (из набора таковых с различным механизмом действия) с соответствующими данными по изменению входного электрического сопротивления корневых клеток под влиянием веществ из того же набора. Задача такого сопоставления - проверить обоснованность симпластической теории Арица (Arisz, 1956), постулирующей отсутствие регулирующего влияния плазмодесм на передвижение воды и ионов по симпласту.

8. Исследована возможная роль плазмодесм в электрической поляризации плазмалеммы в клетках корневого симпласта, а также экспериментально показана связь проводимости плазмодесм для воды и ионов с энергетическим метаболизмом клеток.

Основные элементы научной новизны. Данная работа - первое исследование, в котором вопросы регуляции водообмена и формирования водоудерживающей способности у клеток в высших растениях рассмотрены на основе представления о двух путях трансмембранного водообмена (диффузионно-растворительного механизма транспорта воды через липидную фазу мембран и механизма однорядной диффузии через белковые водные поры). В качестве реальных претендентов на роль таких белковых водных пор в клеточных мембранах (на примере корней проростков пшеницы) рассматриваются специфические аквапоркны и К⁺-селективные ионные каналы. На основании полученных экспериментальных данных постулируется наличие у клеток в высших растениях защитной водоудерживающей способности на уровне клеточных мембран как ответа на действие неблагоприятных факторов, основанной на уменьшении (частичном или полном закрытии) более эффективного для действия водоотни-мающей силы (градиента водного потенциала на мембране) порового пути трансмембранного водообмена.

Теоретический формализм Левитга (Levitt, 1973) о диффузии молекул воды в узкой однорядной поре с размером, сравнимым с размером молекул воды (радиус поры « 3 А) «переведен» с «языка» условной вероятности для одномер-

ного перемещения молекул по узкой длинной поре на «язык» ЯМР (получено аналитическое выражение для временной зависимости относительной амплитуды сигнала протонного эха прн равновероятной ориентации пор относительно вектора градиента магнитного поля, характерной для реальных биологических объектов), а также получено прямое экспериментальное подтверждение наличия качественного сходства механизма диффузии воды в естественных клеточных мембранах с нефиковской диффузией молекул воды, характерной для формализма Левитта.

Обнаружен феномен быстрого перехода тонопласта in situ из состояния с высоким электрическим сопротивлением в состояние повышенной проводимости для входящего в вакуоль тока («захват» избытка катионов цитоплазмы) под влиянием кратковременного (< 5 мсек) макроскопического переходного тока через локальный участок плазмалеммы изолированного из клетки высшего растения протопласта, возникающего при фиксации на этом локальном участке скачка повышенного гиперполяризующего напряжения.

Установлены элементы специфичности ауксининдуцированного набухания изолированных протопластов, связанные с предшествующей набуханию активацией протонного насоса плазмалеммы и с участием К⁺-селективных ионных каналов плазмалеммы в механизме такого набухания (поступления воды).

Путем совместного использования метода ЯМР и одноэлектродного метода фиксации тока (current clamp) установлено: 1) что при различных фармакологических воздействиях на клетки корня возможно как взаимосопряженное изменение проводимости плазмодесм для воды и для ионов, так и независимая от потока воды регуляция ионного транспорта по плазмодесмам; 2) что регуляция (изменение) проводимости плазмодесм для воды и ионов связана с энергетическим метаболизмом клеток корня; 3) что между клетками в симпласте корня возможна электрическая неэквипотенциальность. Эти обстоятельства, в противоположность синпластической теории Арица, позволяют принципиально по новому оценивать роль плазмодесм в транспорте воды и ионов между клетками в корне

Научно-практическая ценность. Результаты данной работы дают новое представление о регуляции транспорта воды через клеточные мембраны. Это позволяет на новой основе подойти к решению не только фундаментальных проблем мембранологии, но и одной из центральных проблем практического растениеводства - механизмов формирования водоудерживающей способности растительных клеток на уровне клеточных мембран. В этой связи результаты работы могут быть использованы при совершенствовании программ оптимального орошения сельскохозяйственных культур, а также в разработках научно-

обоснованных приемов сушки и консервирования сельскохозяйственной продукции.

Результаты работы имеют фундаментальной значение для построения теории корневой экссудации, а также дают новый подход к изучению функционирования тонопласта in situ и проблей вакуолизации растительных клеток.

Материалы диссертации и методические разработки, содержащиеся в ней, могут найти применение в научных лабораториях биофизического и агрофизического профиля, а также могут использоваться при чтении лекций по теоретическим основам водного режима биологических систем, по физиологии корневого питания растений и по биофизике их клеточных мембран.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном симпозиуме «Водный режим в связи с различными экологическими условиями» (Казань, 1976), на Всесоюзном симпозиуме «Магнитный резонанс в биологии и медицине» (Звенигород, 1977), на XXIV Международном конгрессе AMPERE (Таллин, 1978), на Международной конференции «Вода и ионы в биологических системах» (Румыния, Бухарест, 1980), на VII Всесоюзном симпозиуме по водному режиму растений (Киев, 1981), на семинаре участников Программы сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме «Вода и ионы в биологических системах» (Москва, 1981), на Первом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на Сабининских семинарзх ИФР АН СССР (Москва, 1984, 1985, 1987), на Всесоюзных школах «Биомембраны» (Звенигород, 1986, 1988), На Всесоюзной конференции «Физиолого-геиетические аспекты минерального питания растений» (Киев, 1990), на III съезде ВОФР (С.-Петербург, 1993), на II съезде Украинского общества физиологов растений (Киев, 1993), на расширенных семинарах отдела клеточной биологии Казанского института биологии КНЦ РАН (1993 - 1995), на Итоговых научных конференциях Казанского научного центра РАН (КФ АН СССР, Казань, 1989 - 1997 гг.). Диссертация апробирована на объединенном семинаре Казанского института биологии КНЦ РАН (Казань, 1997) и на заседании Ученого Совета КИБ КНЦ РАН (Казань, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена в форме монографии на 333 страницах, содержит 63 рисунка и 5 таблиц. Состоит из введения и трех разделов, каждый из которых, в свою очередь, содержит по три главы. Диссертация завершается основными выводами и списком литературы, включающим 516 наименования, из которых 194 - на русском языке.

Объекты и основные методы исследований Объектами исследований являлись отсеченные корни проростков пшеницы (Triticum aestivum L.), а также

протопласты из клеток стеблей проростков бобов (Vicia faba), н гороха (Pisum sativum).

Для изучения диффузионной водопроницаемости клеточных мембран использован импульсный метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Выход воды из корней в гипертонические растворы осмотнков за фиксированный отрезок времени количественно оценивали рефрактометрическим методом. Для регистрации мембранного потенциала и входного электрического сопротивления корневых клеток использовали одноэлектродный метод фиксации тока (current clamp). На изолированных протопластах применена также ПЭТЧ-регистрация при неплотном контакте стеклянной микропипетки с поверхностью мембраны (loose patch clamp). Более подробная информация об объектах и методах исследований - в соответствующих разделах диссертации.