Введение к работе
Актуальность проблемы
Стабильность к воздействию различных факторов внешней среды является одной из важнейших характеристик макромолекул, обеспечивающих их успешное функционирование в живой клетке. Стабильность структуры белка определяется хрупким балансом различных физических взаимодействий на внутримолекулярном и межмолекулярном уровнях. Направление исследования факторов, влияющих на стабильность белка (в том числе, его термостабильность), имеет не только академическое значение, но и огромный прикладной потенциал. Дело в том, что направленное увеличение стабильности белков очень важно при решении множества прикладных биотехнологических задач. К примеру, ферменты, сохраняющие активность при высокой температуре, дают существенные преимущества при применении в различных биотехнологических процессах: они обладают большей продуктивностью вследствие ускорения химических реакций при повышенной температуре; при этом культуральная среда в меньшей степени подвержена загрязнению чужеродными микроорганизмами; термостабильные белки менее склонны к образованию агрегированных форм, препятствующих протеканию биотехнологических процессов. Следует отметить, что и низкая стабильность молекулы белка может обеспечивать определенные преимущества. Например, отсутствие жесткой третичной структуры у представителей семейства белков с внутренней неупорядоченностью позволяет эффективно взаимодействовать с несколькими различными мишенями.
Одной из ключевых характеристик теплового поведения белка является свойство молекулы белка претерпевать согласованные конформационные изменения, что принято называть структурной (или глобальной) кооперативностью. Степень структурной кооперативности белка обуславливает путь, по которому будет протекать структурный переход в белке: это может быть простой переход между двумя состояниями или сложный процесс, включающий в себя формирование промежуточного
-\
2 состояния (интермедиата), возможны и более сложные варианты. Как наличие, так и отсутствие структурной кооперативности чрезвычайно важно для функционирования белков.
Несмотря на огромные успехи в установлении трехмерных структур белков, знание пространственной структуры белка не позволяет однозначно судить ни о его термостабильности, .ни, тем более, о наличии возможных иптермедиатов тепловой денатурации. Показано, что даже структурно схожие белки могут обладать как существенно различной термостабильностью, так и разной структурной кооперативностью. Ситуация дополнительно осложняется в случае металл-связывающих белков, поскольку подавляющее большинство работ, посвященных исследованиям факторов, влияющих на стабильность структуры белка, если и рассматривают металл-связывающие белки, то вне контекста их металл-связывающей способности.
Цели и задачи исследования
Цель работы - изучение особенностей теплового поведения металл-связывающих белков, на примере «классического» представителя семейства кальций-связывающих белков, парвальбумина.
В соответствии с целью и выбором объекта исследования были поставлены следующие задачи:
Исследовать структурные переходы, происходящие в апо-форме парвальбумина под воздействием температуры и денатурирующих агентов.
Изучить влияние связывания физиологически значимых катионов металлов на тепловые переходы в парвальбуминах.
Научная новизна
Впервые получена апо-форма парвальбумина, т.е. форма, свободная от каких-либо катионов металлов. С помощью спектральных и теплофизических методов, а также теоретических предсказаний показано, что она лишена жесткой третичной структуры, т. е. является белком с внутренней неупорядоченностью.
Обнаружен непрерывный тепловой переход в апо-форме ПА.
Показано, что структурная кооперативность ПА определяется видом связанных катионов металлов, варьируя в широчайших пределах: от отсутствия тепловых переходов первого рода, до простого перехода между двумя состояниями, а также сложного механизма тепловой денатурации с участием, по меньшей мере, одного интермедиата. Показано, что наличие двух
2+
термодинамических доменов в Са -насыщенной форме а-ПА щуки является следствием стабилизации промежуточного состояния связанными ионами Са , а также ослабления взаимодействий между субдоменами CD и EF за счет увеличения объема изолированных полостей.
Научно-практическая значимость
Результаты, полученные в настоящей работе, показывают, что при изучении апо-форм металл-связывающих белков, обладающих предельно
высоким сродством к ионам металлов, необходимо обеспечивать полный отрыв от белка всех связанных катионов металлов, включая моновалентные. Результаты работы свидетельствуют о том, что дополнительный термодинамический домен может возникать не только вследствие больших размеров белка, но и благодаря стабилизации промежуточного состояния, вызываемой связыванием лиганда. Примененная в работе комбинация теоретических методов исследования структуры белков может быть успешно применена для оценки стабильности белков, а также предсказания наличия в них дополнительных термодинамических доменов. В целом, работа способствует пониманию структурных факторов, влияющих на тепловое поведение металл-связывающих белков, что может быть востребовано при решении многих прикладных задач: создания лекарственных средств белковой природы, различных биотехнологических применений, и пр.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях:
11-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007)
12-ая международная школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008)
Intl. Symposium «Biological motility: achievements and perspectives» (Pushchino, 2008)
Структура и объем диссертации
