Введение к работе
Актуальность темы: В настоящее время не вызывает сомнения, что специфические транспортные системы - ионные каналы, представляющие собой особый класс мембранных белков, определяют и принимают непосредственное участие в процессах рецепции, генерации и передачи нервного импульса, секреции и многих других. Многие из продуцируемых микроорганизмами токсинов, которые не только ответственны за клинические проявления заболевания, но и создают условия для существования самих бактерий, осуществляют свои функции через формирование в мембранах клеток-мишеней трансмембранных ионных каналов. Одним из таких токсинов,' изучению которого в последние годы уделяется пристальное внимание, может быть признан а-стафилотоксин (СТ). являющийся одним из важных факторов патогенности Staphylococcus aureus. Интенсивное исследование взаимодействия зтого токсина с мембранами связано еще и с тем. что образуемые СТ ионные каналы в липидных бислоях являются одной из весьма удачных моделей ионных каналов, существующих в биомембранах.
Содружество между биофизикой, молекулярной физиологией и генной инженерией привело к впечатляющим успехам в изучении олигомерного строения СТ-канала и установления зависимости формирования,, функционирования и свойств канала от рН. липид-ного состава мембран и величины трансмембранного потенциала. Однако еще и сегодня молекулярные механизмы, определяющие биологические эффекты токсина, остаются во многом неясными. Гипотетична и роль отдельных частей (доменов) молекулы СТ в обеспечении свойств канала.
Цель и задачи работы:
. Цєльї> настоящей работа было изучение влияния изменений в структуре стафилококкового а-токсина на свойства формируемых им ионных каналов с бисшгических и искусственных мембранах. В процессе исследования решались следующие задачи:
-
оценить влияние мягкой протеолитической обработки токсина трипсином и протеиназой К на его биологическую и канало-Формерную активности.
-
Провести сравнительный анализ свойств (проводимость, катион-анионная солективость. вольтамперные характеристики и др.) ионных каналов, формируемых нативным и протеолитически разрезанными Формами токсина в липидных бислоях.
-
определить геометрические параметри трансмембранних пор формируемых нативным и протеолитически разрезанными форма-«II токсина в биологических н искусственных мембранах.
Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые установлено, что:
-
несмотря на практически полную потерю а-стафилотокси-ном (в результате трипсинолиза) гемолитической активности летальная и каналоформерная активности сохраняются на относительно высоком уровне:
-
мягкая обработка токсина протеиназой К. уменьшая вдвое гемолитическую активность токсина, не только не уменьшала, но даже (при малых временах обработки) слегка увеличивала его каналоформерную активность;
.3) ионные каналы, формируемые препаратами СТ. после ограниченного протеолиза различными ферментами имеют в несколько
раз меньшую проводимость, чем каналы, формируемые нативным токсином, хотя максимальные диаметры их водных пор отличаются незначительно;
4) свойства каналов формируемых нативными и протеолитически разрезанными молекулами СТ резко отличаются: так, их вольт-амперные характеристики менялись от почти линейных до резко асимметричных, а селективность - от анионной до катион-ной.
Компьютерный анализ математической модели канала позволил выявить, что основные различия между каналами, сформированными нативным и разрезанными молекулами токсина, локализуются на "транс"-входе в канал, где увеличивается влияние групп,' несущих отрицательные заряд. Так как общим местом 'действия обеих использованных протеаз является глицин-богатая .центральная часть молекулы токсина, то эта часть очевидно проникает через липидный бислой и принимает участие в формировании "транс"-входа в канал.
Практическая ценность работа:
Полученные экспериментальные данные углубляют знания о структурно-функциональных взаимосвязях между структурой молекулы а-стафилотоксина и свойствах формируемого им ионного канала.
Установленные различия в свойствах каналов, образуемых нативннми и протеолитически разрезанными молекулами токсина, очевидно лежат в основе отдельных биоэффектов токсина In vivo и должны приниматься во внимание при разработке новых методов терапии при стафилококковой инфекции.
Результаты работа представляют интерес для специали~їов. занимающихся проблемами ионного транспорта, и могут найти применение в биофизике, биохимии и медицине.
Апробация работы: Результаты работы были доложены на IV съезде физиологов Узбекистана (Ташкент - 1988).на 2-ой Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины".' - (Юрмала, Латвия -1939), на научной конференции "Структура и функции биологических мембран" ( Ташкент - 1995 ), на семинарах лаборатории молекулярной Физиологии Института физиологии и биофизики АН ГУз.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, нклэтаэдих обзор литературных данных, главы с описанием материалов и методов исследования, двух глав изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитнреганнон літератури, содержащего 163 наименований. Диссертация еодг'рпп' Г5 рисунков.