Введение к работе
Актуальность теми. Еще в 1953 году после открытия Уотсоном и Криком структуры ДНК. одним из главных вопросов молекулярной биологии, стал следующий: зависит ли локальная пространственная структура ДНК от последовательности? А если зависит, то каким образом. Значение этого вопроса очевидно, поскольку, в принципе, информация с ДНК может считываться как напрямую, через распознавание химически различных функциональных групп нуклеотидов, составляющее молекулу ДНК, так и опосредованно, через распознавание локальных структурных отличий, возшжащих вследствие различия в первичной (химической) последовательности ДНК. Действительно, анализ кристаллических структур ДНК и ЯНК-белковых комплексов показывает, что молекула ДНК далеко не тохожа на жесткую и регулярную двойную спираль. Такие отклонения зт канонической В-фзрмы, как изгиб ъ. даже излом оси спирали, значительные локальные вариации в угле спирального вращения, тляются скорее правилом, чем исключением. Знание детальной трехмерной структуры ДНК, а также ДНК:РНКовых гибридов, которые ївляются промежуточными звеньями переноса генетической информации і процессах транскрипции и обратной транскрипции, представляется гоэтому чрезвычайно важным для понимания молекулярных механизмов зундаментальных биологических процессов.
Единственным прямым методом для определения структуры іакромолекул в растворе является спектроскопия ядерного іагкитного резонанса (ЯМР) с последующи применением методов юлекулярной динамики и конформационного анализа. Применение :одобнсй методики к проблеме определения влияния нуклеотидной оследовательности на структуру двойной спирали ДЧК и НКгРНКового гибрида и является темой данной диссертационной аботы.
В настоящей работе решались следующие научные вопросы:
1. Определение структуры АпТт треков в растворе. Как было становлено в ходе многочисленных исследований подобных эследовательностей, они обладают рядом свойств, отличающих их от Зычной ДНК. В настоящей работе определены конформационные эстояния AnTm треков, совместимые с данными ЯМР и зоанализированы структурные факторы, ответственные за уникальные :ізико'-химические свойства таких трекоБ.
2. Определение забиеилости структуры д&ойной спирали ДНК от
- г -
нуклетидной последовательности. Целью настоящей работы являлся поиск закономерностей в спектрах ЯМР серии различных олигонуклетидов с последующим поиском связи мезду измеряемыми межпротонными расстояниями и структурными параметрами двойной спирали ДНК. В результате этого удалось установить эмпирические правила, описыващие зависимость определенных структурных параметров ДНК от последовательности.
3. Определение структуры d(GAATTTAAATTC)2 6 растворе
методами спектроскопии ЯМР и лолекуларной динамики. Как следует
из разработанной модели изгиба двойной спирали ДНК, в центре этой
молекулы должен присутствовать изгиб оси спирали, направленный в
сторону главного желоба. Кроме того, в литературе практически
отсутствуют структурные данные о Т А последовательностях. Всё
это обусловило выбор объекта исследования.
4. Определение детальной пространственной структури
ДНК:РНКового гибрида. Основной мотивацией исследования была
широко распространенная неясность и обилие противоречий в
литературе относительно структуры ДНК:РНК гибрида. Достигнутый за
последний годы прогрес в области ЯМР спектроскопии позволяет
прояснить этот вопрос. Целью данной работы являлось определение
точной трехмерной структуры d(GTCACATG):r(caugugac) дуплекса в
растворе.
Научная новизна работы.
Впервые проанализированы различные факторы, которые могут определять структурные черты и физико-химические свойства А последовательностей. Также определены и конформационные состояния этих последовательностей, совместимые с данными ЯМР.
Был разработан и применен оригинальный подход к извлечению информации о структуре двойной спирали ДНК в растворе из сравнения ЯМ? спектров различных олигонуклеотидов. Подобный подход позволяет избежать ряд проблем возникающих в процессе восстановления трехмерной структуры нуклеиновых кислот по данным спектроскопии ЯМР. Кроме того, лишь благодаря ему удалось установить сам факт наличия связи между нуклеотидной последовательностью и структурой ДНК в растворе. Хотя наличие подобной связи и предполагалось практически во всех работах, посвященных исследованию структуры ДНК в растворе, данная работа оказалась первой надежной демонстрацией подобной связи.
В настоящей работе докладывается первое в мировой практике определение детальной структуры ДНК:РНКового гибрида в растворе.
Полученная структура отличается от канонических А- и В- форм и обладает рядом специфических структурных черт. На основе полученных результатов предложен механизм посредством которого фермент RNase н способен различать ДНК:РНК гибриды и чисто РНК дуплексы и специфически гидролизовать первые.
Практическая ценность диссертации заключается в определение связи между нуклеотидной последовательностью ДНК и рядом её структурных параметров, что может быть использовано для предсказания и экспериментального определения структуры любых других ДНК дуплексов с желаемой последовательностью. Особо следует отметить практическую ценность знания структуры ДНК:РНК гибрида и механизма его взаимодействия с RNase Н. В последнее время растёт интерес к использованию антисмысловых олигонуклеотидов к направленной регуляции экспрессии как нормальных генов, так и различных патогенов. Это может привести к универсальному методу лечения мириада человеческих болезней. Как было установлено, фармакологическая активность олигонуклеотидов различного типа сильно зависит от их способности образовывать дуплекс с РНК , доступный для гидролиза RNase Н. Применение результатов работы позволит направленным образом модифицировать свойства олигонуклеотидов с целью улучшения их активности.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на і Советско-Германском симпозиуме "Protein-nucleic-acid interaction: structural and pharmacological aspects", Ленинград, июль 1991; " 8th conversation in biomolecular stereodynamics", Олбани, США, июнь 1991; "34 Experimental MR conference (EHC)", Сент-Луис, март 1993.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей в ведущих международных журналах.