Введение к работе
Актуальность темы
Фундаментальной проблемой молекулярной биологии является разработка методов направленного регулирования синтеза белка и репликации генов. Эта задача кроме общебиологического имеет чрезвычайно важное практическое медицинское значение. Одними из наиболее перспективных путей решения этой проблемы считаются «антисенс»- и «антиген»-технологии. Первая заключается в образовании «адресуемыми» оли-гонуклеотидами дуплексов с РНК. Вторая - в образовании трехцепочечных комплексов (триплексов) с дуплексами ДНК. На сегодняшний день наиболее интенсивно разрабатывается «антигенная» технология. «Антигенная» технология может найти широкое применение при решении многих задач биохимии и молекулярной биологии, а так же в практической медицине («антигенная» терапия вирусных и онкологических заболеваний).
Она может быть реализована в двух вариантах - с образованием «антипараллельных» (третья цепь ориентирована антипараллельно идентичной цепи уотсон-криковского дуплекса ДНК) и «параллельных» (с параллельными идентичными цепями) триплексов. Первый вариант предполагает наличие в дуплексе достаточно продолжительных полипуриновых (полипири^идиновых) последовательностей, что существенно ограничивает область его практического использования. Второй вариант, предложенный в нашей Лаборатории, лишен этого недостатка. Однако стабильность параллельных триплексов недостаточна для их практического использования. Поэтому весьма важным и актуальным является разработка подходов к повышению стабильности как «антисенс»-дуплексов, так и, в особенности, параллельных триплексов.
Мель диссертации
Целью данной диссертации являлось изучение влияния интеркалирующего красителя метндия, связанного с межнуклеотидной связью линкером соответствующей длины на стабильность и свойства ДНК-дуплексов и параллельных триплексов. Предполагалось, что интеркаляция метидия в спиральные структуры может существенно повысить их стабильность. Кроме того, представлялось интересным и важным установить, насколько интеркаляция связанного красителя возмущает пространственную структуру нативных дуплексов и триплексов.
Научная новизна
Сконструированы модельные соединения с заранее определенным местом интер-каляции лиганда между нуклеотидами. Эти соединения представляют собой олигонук-леотиды, в межнуклеотидную связь которых введена вставка, содержащая интеркаля-тор, присоединенный через линкер подходящей длины. Разработаны методы синтеза такой вставки и использования ее в стандартном олигонуклеотидном синтезе. Изучение физико-химических свойств модифицированных олигонуклеотидов позволило доказать, что ковалентно присоединенный краситель интеркалирует в нуклеотидную последовательность как ДНК-дуплексов, так и параллельных триплексов. Показана стабилизация двойной и тройной спиралей ковалентно присоединенным метидием.
С использованием метода молекулярной механики показано, что:
интеркаляция метидия между основаниями дуплекса происходит только в тот сте-
кинг-контакт, к межнуклеотидной связи которого присоединена вставка;
модифицированный дуплекс имеет наиболее стабильную структуру, когда кова
лентно присоединенный метидий интеркалирует между основаниями дуплекса со
стороны большой бороздки.
Вопросы, выносимые на защиту
-
Исследование спектральных свойств и определение термодинамических параметров образования межмолекулярного дуплекса с межнуклеотидной вставкой, содержащей интеркалирующий краситель метидий.
-
Доказательство интеркаляцни ковалентно присоединенного лиганда метидия в двойную спираль короткого олигонуклеотидного дуплекса.
-
Описание модели олигонуклеотидного дуплекса с ковалентно присоединенным ин-теркалятором (метидием).
-
Исследование спектральных свойств и определение термодинамических параметров внутримолекулярного параллельного триплекса с межнуклеотидной вставкой, содержащей интеркалирующий краситель метидий.
Апробация работы и публикации
Материалы, изложенные в диссертации, были представлены в виде стендового доклада на IV Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии ( Июль 1999 г. ) и на конференции XIII International Round, Table Nucleosides, Nucleotides, and their Biological Applications ( Сентябрь, 1998 г.).
Основные результаты диссертации опубликованы в работах [1, 2, 3].
Структура диссертации