Введение к работе
Актуальность темы. Работа посвящена исследованию влияния дена-гурирующих агентов на структуру и ферментативную активность рибонуклеази А с целью установления корреляции между ними.- Хорошо из-эестно, что биологическая, в частности, ферментативная активность 5елка определяется его уникальной пространственной структурой, однако, природа этой взаимосвязи на сегодняшний день остается непонятой, в особенности это касается той большей части глобулы, которая іє является активным центром фермента. Достоверно известным можно считать лишь тот факт, что молекула фермента не способна выполнять шталитичеекие функции,если её пространственная структура полностью эазрушена. Таким образом, один из аспектов проблемы связан с попыткой установить, какие именно параметры макромолекулы фермента как эиэико-химической системы и каким образом определяют её способность рункционировать. Для решения этой проблемы существует несколько юдходов, один из которых основан на прямом сопоставлении изменения :труктуры фермента и его каталитических свойств при изменении пара-іетров окружающей среды (температуры, рН, состава растворителя). [опытки провести такого рода исследования предпринимались ранее не-іднократно, однако, в большинстве случаев оказались безуспешными, юскольку, ферментативная активность, как правило, полностью исчезла в отсутствие сколько-нибудь заметных структурных изменений. Это івязано с тем, что методы,используемые для регистрации конформаци-інньк изменений, фиксируют толькс глобальный переход - порядок-бес-юрядок и не чувствительны к небольшим изменениям структуры, кото-ие, возможно и являются причиной ингибирования ферментативной ак-ивности. Предпосылкой для постановки такой задачи в данной работе вляется уникальная возможность метода тритиевой метки обнаруживать чень небольшие конформациоиные изменения, заключающиеся в изменении терической доступности аминокислотных остатков в составе глобулы елка. Возможность сопоставить такого рода конформациоиные измене-ия с изменениями ферментативной активности представляет двоякий нтерес. С одной стороны, это может пролить свет на роль конформа-ионных изменений в биокагализе, а с другой стороны,дает возмож-ость исследовать механизм и путь влияния пертурбирующих агентов вплоть до денатурации) на конфорыацив белка. Оба вопроса являются есьма актуальными на сегодняшний день. -І5П
Цель и задачи исследования. Целью работы является установление корреляции между структурой и ферментативной активностью рибонуклеази А. Сущность предлагаемого для этой цели подхода заключается в том, что с помощью метода тритиевой метки проведено сопоставление изменения доступности аминокислотных остатков рибонуклеази А для атомов трития с изменениями ферментативной активности при добавлении к раствору фермента пертурбирующих агентов - хлорида лития и гуанидина, мочевины. При этом были поставлены следующие конкретные задачи: выяснить, во-первых, существуют ли промежуточные состояния при денатурации рибонуклеази А; во-вторых, идет ли идентичным путем денатурация белка под влиянием различных денатурантов; в-третьих, существует ли связь между изменениями конформации в растворах денатурантов и функциональной активностью фермента. Самостоятельный интерес представляет исследование изменений структуры и ферментативной активности в процессе повторного свертывания.
Научная новиан» работы. Методом тритиевой метки обнаружены структурные переходы рибонуклеази А неденатурационного характера, выражающиеся в уменьшении или увеличении доступности аминокислотных остатков, вызываемые незначительными изменениями состава растворителя. Уменьшение доступности, наблюдаемое для остатков, расположенных на или вблизи поверхности глобулы, трактуется как сжатие её внешней оболочки, увеличение - наиболее заметное для гидрофобных остатков, составляющих ядро глобулы, как переход в предденатураци-онное состояние типа "расплавленная" глобула. Как сжатие, так и расширение глобулы сопровождается ингибированием ее ферментативной активности. Существование прямой и обратной корреляции между доступностью остатков (или, что, то же самое, свободным объёмом) глобулы и ее ферментативной активностью свидетельствует о критическом характере взаимосвязи между ними: максимальной ферментативной активности соответствует определенный оптимальный свободный объем глобулы. Результаты по установлению корреляции между структурой и ферментативной активностью получены впервые. В литературе также нет данных о сжатии глобулы в растворах солей.
Теоретическое и практическое значение работы. Основное научное значение работы заключается в том, что используемый в работе подход - параллельное исследование структуры и функции белка под дей-
-з - -/
ствием пертурбирующих агентов - открывает перспективы для решения фундаментальных проблем, расширяющих представления о явлении биокатализа. Во-первых, появляется возможность установить, какие параметры структуры и каким образом определяют способность белка быть биокатализатором химических реакций, какова при этом роль конформа-ционных перестроек белка.Установление корреляции между доступностью аминокислотных остатков и ферментативной активностью показывает,что одним из таких параметров является свободный объем глобулы, который, как видно из результатов работы,должен иметь определенное оптимальное значение для проведения максимальной ферментативной активности. Поскольку свободный объем непосредственно связан с внутримолекулярной подвижностью глобулы, то следует ожидать,что тот же критический характер взаимосвязи должен существовать между динамикой белка и его ферментативной активностью. Во-вторых, расширение круга пертур-бирующих агентов открывает возможность исследовать механизм и путь влияния компонентов окружающего растворителя на ферментативную активность белка, установить общие принципиальные механизмы инактивации ферментов.
Другой аспект научного значения работы связан с обнаружением неизвестного до сих пор типа изменения структуры белка, заключающегося в сжатий внешней оболочки глобулы в растворах солей физиологических концентраций. Если это явление имеет общий характер (эффект обнаружен и для других белков и солей в лаборатории структурной организации биологических систем Отдела строения вещества ИХФ АН СССР), то можно предположить, что ионная сила может выступать в качестве регуляторного фактора іл Ыъо . и не только в процессах биокатализа, но и других функций белка.
И,наконец, в работе получено экспериментальное подтверждение гипотезы, согласно которой ферментативная активность белка определяется не его глобальной "грубой" (по Птицыну) структурой, а особенностями его "детальной" структуры, поскольку ингибирование ферментативной активности, наблюдаемое в работе, происходит на фоне сохранения "нативности" пространственной структуры белка (вторичная структура, размер молекулы, её спектральные характеристики остаются неизменными в условиях эксперимента).
Практическое значение работы, прежде всего, может быть связано i-ffXl
й проблемами белковой и, в частности, ферментной инженерии. Кроме того, результаты работы представляют интерес для исследователей в области физико-химии белков и ферментов. Сильная зависимость структуры и активности фермента от присутствия в растворе солей даже в небольших концентрациях ( ~ 0,5 М) диктует необходимость тщательно учитывать состав используемых буферных смесей. На практике этому придается мало значения, поскольку всем кажется, что соли не изменяют структуру белка, и, по-видимому, это часто является причиной получения противоречивых результатов.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на: Международной конференции „Химическая физика ферментативного катализа", Таллинн, 1987; Втором Всесоюзном совещании по проблеме "Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами", Звенигород, 1988; Совещании по проблеме "Физическая химия ферментов", Одесса, 1988; Конференции молодых ученых Октябрьского района г. Москвы "ЮТМ-88", Москва, 1988; 19-ой научной конференции мол. ученых биол. факультета МІУ "Проблемы современной биологии", Москва, 1988; Конференции молодых ученых ИХФ АН СССР, Москва, 1987; Всесоюзной конференции ВОФР "Мембраны растительных клеток, проблемы и перспективы", Чершгов, 1989; Международной конференции "Влияние воды на молекулярно-динамические процессы в биосистемах и их связь с метаболизмом", Лагодехи, 1989.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 32 рисунками, б таблицами и I схемой. Список цитированной литературы содержит 109 наименований.