Введение к работе
Актуальность темы.
Выяснение роли внутримолекулярной подвижности в функционировании биополимеров вообще и в процессе ферментативного катализа в частности является одной из фундаментальных проблем современной молекулярной биофизики. Несмотря на многолетние исследования, пока не существует однозначного и окончательного ответа на вопрос о функциональной необходимости конформационных изменений в процессе каталитического акта.
Традиционно подавляющее большинство исследований свойств белков было выполнено на растворах. Однако изучение механохимических взаимодействий в белках потребовало разработки способов иммобилизации молекул, т.к. еще в 1942г В.А.Энгельгардт и М.Н.Любимова отмечали, что в растворе невозможно строго контролировать прикладываемые нагрузки, и интерпретация результатов сильно затруднена. Прямое доказательство необходимости таких движений можно получить, только если контролируемым образом наложить ограничения на конформаци-онную подвижность глобулы и измерить влияние таких ограничений на удельную активность.
В последнее время было предложено два пути исследования влияния деформации на каталитическую активность. В первом случае молекулы подвергались деформации в гидродинамическом поле (1), во втором глобулы пришивали ковалентно к поверхности полимерного волокна и деформировали вместе с ним (2). В этих исследованиях найдена сильная зависимость активности от деформации, однако оба подхода обладают рядом недостатков. Непостоянная и неконтролируемая деформация белковых молекул в гидродинамическом методе вызывает трудности при интерпретации результатов на молекулярном уровне. Метод, использующий иммобилизацию белка на поверхности эластичного волокна, имеет те же ограничения: силы, прикладываемые таким образом к молекулам, различны по величине и ориентированы случайным образом.
Удобным объектом для изучения механохимических свойств является белковый кристалл. Во-первых, такой выбор объекта позволяет обойти указанные выше затруднения, поскольку молекулы в кристалле расположены строго упорядоченно и прикладываемая нагрузка распределяется между молекулами равномерно. Т.к. упа-
ковка молекул известна из РСА, то, деформируя кристалл в различных направлениях, мы имеем возможность воздействовать на разные степени свободы белковых молекул. Во-вторых, кристаллизация многих белков-ферментов приводит к сильному снижению их удельной активности даже в отсутствие всяких стерических и диффузионных ограничений (3). Поэтому можно ожидать для таких ферментов, что растяжение кристалла будет снимать ингибирова-ние активности силами кристаллической решетки.
Цель и задачи работы.
Задачей настоящего исследования является разработка нового подхода к изучению механохимических взаимодействий в белках-ферментах, основанного на использовании монокристаллов ферментов в качестве объекта исследования.
Для решения поставленной задачи потребовалось:
1 .Усовершенствовать микрометод, разработанный
В.Н.Морозовым для измерения ферментативной активности кристаллических срезов и пленок белков, с целью обеспечения возможности одновременного измерения активности и напряжения в образце, а также стабильности измерений скорости реакции.
2.Провести изучение влияния одноосной механической деформации на каталитическую активность карбоксипептидазы А (СРА).
З.С целью выяснения физических механизмов, лежащих в основе обнаруженных эффектов деформации провести исследование влияния температуры, ингибиторов и денатурирующих агентов на удельную активность кристаллов СРА.
Научная новизна.
Новый микрометод для исследования поведения активности кристаллических образцов под нагрузкой позволил впервые изучить влияние одноосной механической деформации на удельную активность при контролируемой нагрузке в образце. Обнаружено многократное (до 30 раз) увеличение удельной активности в ответ на деформацию образца. Показано, что такой рост активности при растяжении не связан со снятием диффузионных ограничений. Впервые изучено воздействие гуанидин гидрохлорида на кристаллическую карбоксипептидазу А и показано, что эффект возрастания активности при растяжении пропадает в присутствии GuHCl.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что сильное падение ферментативной активности при кристаллизации белка связано с ограничением конформационной подвижности, наложенным силами кристаллической решетки, несмотря на то, что рентгеноструктурные исследования не выявили крупномасштабных движений в процессе связывания аналогов субстратов.
Практическое значение работы.
Результаты проведенного исследования влияния деформации на различные параметры кристаллического среза СРА важны для понимания фундаментальных вопросов молекулярной биофизики: для подтверждения необходимости свободных конформационных движений в каталитическом цикле и выявления связи физических и химических процессов, происходящих в кристаллическом белке под действием различных внешних воздействий.
Полученный впервые эффект возрастания активности при деформации белкового кристалла может послужить основой для разработки методов быстрого внешнего управления скоростью ферментативной реакции.
Впервые примененный в данной диссертации микрометод может быть использован для изучения поведения белковых молекул под нагрузкой и для выяснения влияния различных биотехнологических процессов на каталитические свойства белков.
Апробация работы.
Результаты работы докладывались на Институтской научной конференции (декабрь 1993).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.
Структура и объем диссертации.