Введение к работе
Актуальность теиы диссертации
Изучение механизмов преобразования энергии живыми клетками относится к одной из важнейших и до конца не решенных проблем современной биологии. Как стало очевидным в последние десятилетия, основной зоной преобразования энергии света и окисляемых субстратов в доступную для клетки форму - макроэргическую связь АТФ, являются специализированные, так называемые, сопрягающие мембраны. К настоящему времени строение и физиологические свойства указанных структур, содержащих различные цепи транспорта электронов и особую ферментную систему, синтезирующую АТФ, исследованы достаточно полно. Общепризнано, что энергия электронов, переносимых от окисляемых субстратов на конечный акцептор, как правило кислород, первоначально преобразуется в трансмембранный электрохимический градиент протонов (АцН+), который служит движущей силой синтеза АТФ в АТФ-синтетазном комплексе. Если в изучении функционирования Н+-АТФ-синтетазного комплекса достигнут значительный прогресс, то механизмы трансмембранного переноса прогонов комплексами дыхательной цепи остаются в значительной степени неустановленными. Господствующая до настоящего момента хемиосмотическая теория сопряжения /Mithell, 1966/ сегодня все больше противоречит новейшим данным о строения энергопреобразующих комплексов сопрягающих мембран. В последнее время все активнее привлекаются представления о конформационной подвижности белков сопрягающих комплексов чак ключевом этапе Преобразования энергии. Именно с этих позиций Интерпретируется механизм функционирования АТФ-синтетазного комплекса сопрягающей мембраны. Экспериментальное обоснование роли конформационных перестроек в сопряжении энергии потока электронов и синтеза АТФ представляется, таким образом, актуальной и значимой задачей современной биофизики.
Связь работ» с крупными научными программами
Различные этапы настоящей работы" выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований (регистрационный № 01.89036810) и МП-07 Фонда Фундаментальных Исследований Республики Беларусь.
Цель н задачи исследования
В рамках данного исследования предполагалось выяснить роль конформационной подвижности энергопреобразующих комплексов сопрягающей мембраны митохондрий в акте трансформации энергии. С этой целью был использован ряд химических и физических воздействий, модифицирующих структуру белков, участвующих в процессах преобразования энергии.
- определение влияния бифункциональных белоксшивающих реагентов на параметры функциональной активности компонентов электронтранспортной цепи как в составе интактных митохондрий и искусственных протеолипосом, так и в растворе с детергентом.
- установление модифицирующего действия ограниченного протеолиза на
физиологические характеристики белковых комплексов дыхательной Цепи
митохондрий, участвующих в реакциях преобразования энергии;
выяснение механизма фотодеблокирования 9лектронтранспортной и протонпереносящей функций дыхательной цепи митохондрий, заингйбированной цианидом, а также фотодеблокироваиия изолированной цитохромоксидазы в присутствии других ингибиторов дыхания;
определение зависимости эффекта фотодеблокирования цитохром-с-оксидазы в составе митохондрий от осмотического потенциала среды;
определение действия физиологических концентраций АТФ на каталитические и спектральные параметры изолированной цитохромоксидазы в присутствии ингибиторов;
- анализ влияния видимого света на спектральные свойства изолированной
оксидазы как в присутствии, так и в отсутствие малых лигандов окисленной формы
гема аз.
Научная ноиивпа полученных результатов
Установлено, что ограничение конфирмационной подвижности белков дыхательной цепи митохондрии как в составе интакткых органелл, так и встроенных в искусственные протеолипосомы, не затрагивает их алектронтранспортную, но блокирует электрогенную (протонпереносящую) функцию.
Впервые показано активирующее действие видимого света на функциональную активность цитохромоксидазы митохондрий в присутствии ингибиторов - лигандов окисленной формы гема аз-
Показано выраженное деингибирующее действие физиологических концентраций АТФ на каталитическую активность солюбилизированной цитохромоксидазы.
Обнаружено, что облучение видимым светом существенно модифицирует спектроскопические параметры окисленной формы изолированной оксядазы.
Ограниченный протеолиз интакгНых митохондрий мало влияет На скорость переноса электронов, Но полностью подавляет трансмембранный выброс протонов в дыхательной цепи.
Установлено, что кинетические параметры взаимодействия цитохромоксидазы -митохондрий-с-цианидоМ зависят от осмотическоготкггенциаАа средыГТ.е~находятся~ под мембранным контролем.
Практическая в экономическая значимость полученных результатов
Результаты работы существенно расширяют и углубляют современные представления о функционировании' энергопреобразующих комплексов митохондрий. Помимо этого, Полученные данные позволяют предположить, что некоторые патологические состояния, сопровождающиеся локальным снижением уровня энергетического Метаболизма за. счет угнетения его ключевого звена цитохромоксидазы, могут корректироваться световым воздействием, либо другими модуляторами активности фермента.
Основные положении диссертации, выносимые на защиту
1. Ограничение конформационной подвижности с помощью коаалеитнмх
сшивок, либо ограниченный протеолиз энёргопреобразующих комплексов
митохоидриальной мембраны мало отражается на их алектронгранспортной
активности и полностью подавляет функцию утилизации энергии.
-
Трансмембранный осмотический потенциал существенно влияет на кинетические параметры взаимодействия интегрального белка сопрягающей мембраны цитохромоксидазы, с ингибитором.
-
Видимый свет и . АТФ в физиологических концентрациях меняют кинетические параметры взаимодействия оксидазы с малыми лигандамн-янгибиторами.
4. Видимый свет реактивирует электронтранспортную и протонпереносящую функции цианидного комплекса оксидазы как в составе митохондрий, так и встроенной в искусственные протеолипосомы.
Личный вклад соискателя
Экспериментальный материал получен при решающем участий автора. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно.
Апробации результатов диссертации
Результаты исследований апробированы на I Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (г. Минск, 22-23 ноября 1994 г.).
Опубликованность результатов
По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 1 тезис.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение (2 главы); заключения, выводов и списка использованных источников, содержащей 186 наименований. Работа изложена на 135 страницах, содержит 38 рисунков и 2 таблицы.