Введение к работе
Актуальность темы. Методы структурного исследования, основанные на использовании зондовых сканирующих микроскопий (СЗМ), стали бурно развиваться с начала 80-х годов. Их исключительной особенностью является сверхвысокое пространственное разрешение. Основным направлением развития этой новой области исследования является физика поверхностей твердых тел.
Не разрушающая природа этих методов и их способность работать в различных средах открыла путь для исследования биологических материалов, практически не разрушая их структуры. Появилась уникальная возможность изучения биологических объектов таких как клетки, вирусные частицы, бактериофаги и т.д. с высоким разрешением in vivo.
Несмотря на впечатляющие первые результаты, СЗМ до настоящего времени является молодым методом, т.е. не существует отработанных технологий позволяющих использовать СЗМ для структурных исследований биологических объектов и материалов. В большинстве областей СЗМ развитие теоретических основ находится на начальном этапе.
Основным препятствием при использовании этих методов для изучения биологических материалов в условиях отличных от сверхвысокого вакуума является латеральная подвижность образца. Поэтому для надежной визуализации объектов необходима их фиксация на поверхности используемой подложки.
Данная работа является частью проводимой в Институте биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова комплексной международной программы "Геном человека", одним из аспектов которой является разработка методов физического картирования ДНК с использованием СЗМ.
На момент начала работ по данной теме не существовало методов для визуализации ДНК и других биоматериалов в СЗМ. Поэтому работа по изучению процессов адсорбции биоматериалов и разработка методов их поверхностной фиксации является актуальной и крайне важной для решения задач структурных исследований биообъектов.
Цель работы состояла в изучении процессов адсорбции различных классов биоматериалов на нескольких типах субстратов, разработке методов увеличения энергии связывания и уменьшения воздействия зонда
-2-на объект, а также методов позволяющих получать СЗМ изображения с высоким контрастом и требуемым разрешением таких объектов как ДНК и ДНК-белковые комплексы.
Научная новизна. Впервые разработаны методы СЗМ визуализации макромолекул и их комплексов, позволяющие получать изображения с минимальный искажениями их размерных параметров и высоким соотношением сигнал/шум при атмосферных условиях.
Применение разработанных методов было показано на кристаллах ДНК-гесА белковых комплексов, полученные при этом изображения имеют пространственное разрешение значительно превышающее достигнутое на подобных объектах при использовании других структурных методов и методов подготовки образца. В частности, показано что спираль гесА-белка вокруг ДНК образована 6-ю белковыми глобулами на один виток.
Разработан принципиально новый метод позволяющий значительно уменьшить деформации молекул ДНК при АСМ исследовании, показана его применимость для решения задач связанных с физическим картированием ДНК.
Проведено исследование процессов самоорганизации в двухкомпонентных LB-пленках и показана применимость разработанных подходов для изучения процессов реконструкции мембран.
Практическая ценность. Результаты работы содержат ряд оригинальных опробированных методов, что делает СЗМ методом пригодным для рутинного структурного анализа широкого спектра биологических материалов. Разработанные методы имеют существенное преимущество над традиционными методами структурных исследований такими как электронная микроскопия и рентгеноструктурный анализ Они позволяют проводить исследования образцов без предварительной: контрастирования и в условиях отличных от вакуума. Кроме того, метох более доступен в использовании и позволяет проводить непосредственные измерения таких характеристик объекта как высота (толщина) \ упругость.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались ш на научной конференции в МФТИ (1993), на международном симпозиум! STM-93 в Пекине (1993), на международном симпозиуме Nanostructures-9^ в С-Петербурге (1994), на международном конгрессе ISEM-13 в Парижі (1994) и на международной конференции MICRO-94 в Лондоне (1994).
-3-
Публнкации. По материалам диссертации сделано 6 публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех
глав, заключения и выводов. В первой главе приведен обзор
литературных данных по теории СЗМ и _ее применениям в
биотехнологии. Диссертация изложена на /sc .страницах, содержит
таблиц & . рисунков Библиография включает 23Р
наименований.