Введение к работе
Актуальность темы
Мобильные генетические элементы класса LINE и ретровирусы происходят, как предполагается, от общего древнего LINE-подобного элемента-"предка" (Temin, 1989). Структурная организация этих мобильных элементов дает достаточно оснований для такого предположения: наличие двух специфических открытых рамок трансляции СОРТІ - предполагаемый ген gag и 0РТ2 - предполагаемый ген рої) соответствует основному принципу генетической организации ретровирусов. С помощью компьютерного анализа в потенциальных белковых продуктах, кодируемых 0РТ2 мобильных элементов, как и в обратных транскриптазах ретровирусов, обнаружены высоко консервативные последовательности, соответствующие характеристическим белковым доменам CXiong, Eickbush, 1989). Более того, затем был экспрессирован предполагаемый ген рої LINE-подобного мобильного элемента жокей и идентифицирована рекомбинантная ДНК-полииераза, подобная обратным транскриптазам ретровирусов СIvanov et al. , 1991). На основании этих данных можно считать доказанной структурную и функциональную гомологию 0РТ2 мобильных элементов и гена рої ретровирусов.
В отношении белковых продуктов 0РТ1 ситуация не ясна. Вирусные структурные белки, кодируемые геном gag, не имеют явной гомологии с потенциальными белковыми продуктами 0РТ1' мобильных элементов. Таким образом, все вопросы, касающиеся структуры этих белковых продуктов и их Функций в процессах репродукции мобильных элементов остаются пока открытыми.
Исследование вирусо-подобного структурного белка, кодируемого мобильным LINE-1 элементом человека, представляет особый интерес: известно, что транспозиция такого элемента, сопровождающаяся его вставкой в функциональные гены, является причиной генетических болезней (Hutchinson et al.,1989), а структурный белок, как предполагается, служит необходимым компонентом системы транспозиции этого элемента, играя большую роль в определении ее механизма.
Поэтому представлялось целесообразный провести сравнительный компьютерный анализ потенциальных белковых продуктов, кодируемых 0РТ1 мобильных генетических элементов и белков Gag ретровирусов, используя новые програииы и методы обработки данных. На основании этого анализа выбрать 0РТ1 мобильного элемента для последующего
клонирования и экспрессии, чтобы получить препарат белка, обладающий параметрами, необходимыми для будущих структурно-функциональных исследований.
Цель и основные задачи исследования
Целью настоящей работы явилась попытка найти открытую райку трансляции мобильного генетического элемента, кодирующую вирусо-подобный структурный белок с предсказанными уникальными свойствами и перспективой его исследования, чтобы затем клонировать, экспрессировать и получить препарат этого белка. с заданными параметрами. В соответствие с этим были поставлены следующие задачи:
Провести сравнительный анализ потенциальных белковых продуктов, кодируемых 0РТ1 мобильных элементов разных классов, и белков ретровирусов, кодируемых геном gag.
Изучить структуру и физико-химические свойства потенциального вирусо-подобного белка, кодируемого 0РТ1 LINE-1 элемента человека.
Получить клон-суперпродуцент вирусо-подобного белка. кодируемого LINE-1 элементом человека.
Экспрессировать, выделить и очистить соответствующий рекомбинантный белок естественного размера ("дикого типа"), пригодный, по известным параметрам, для последующего структурно-Функционального анализа.
Научная новизна и практическое значение работы
Проведенный всесторонний компьютерный анализ потенциальных белковых продуктов, кодируемых 0РТ1 мобильных элементов различных типов, позволил выбрать как объект для экспериментального исследования предполагаемый вирусо-подобный ген gag СОРТІ) LINE-1 элемента человека. Мы клонировали и экспрессировали эту последовательность и получили высокоочищенный рекомбинантный белок. В процессе настоящего исследования была разработана методика клонирования и экспрессии, которая дала возможность сконструировать рекомбинантную ДНК, пригодную для синтеза белка в клетках Е.сої і с целью получения продукта "дикого типа", наиболее соответствующего природному белку." Впервые примененный для gag-подобных белков мобильных элементов метод очистки позволил выделить электрофоретически гомогенный препарат белка, по параметрам пригодный для дальнейшего использования в
экспериментах по анализу третичной структуры.
Практическое значение настоящей работы определяется, прежде всего тем, что результаты, полученные здесь, необходимы для развития исследований структуры и функции белков, колируемых мобильными генетическими элементами. В результате настоящей работы получен высокоочищенный стабильный препарат вирусоподобного структурного белка, кодируемого LINE-1 элементом человека. Параметры полученного препарата, а также данные экспериментального и компьютерного анализа свойств белка являются достаточными для последующего определения условий кристаллизации его и корректного планирования ренггено-сгруктурных исследования.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были представлены на Международной конференции "Гены, белки и компьютеры" (Честер, Великобритания, 1992), Международном симпозиуме по биотехнологии (Майами, США, 1993), 11-ом Международном биофизическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1993), Международной конферениии по молекулярному моделированию СШопрон, Венгрия, 1994), научном семинаре Института биофизики клетки РАН (Пушино. 1996). По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание иагериалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, а также заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 98 авторских ссылок. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками и 3 таблицами.