Введение к работе
r,^"'"
>Т2!(ИЯ
——-Актуальность проблемы. Известно, что во многих случаях процесс трансформации нормальной клетки происходит вследствие изменения структуры нуклеиновых кислот. Одновременно известно также, что многие биологически активные вещества, проникая в клетку, связываются в основном, с нуклеиновыми кислотами, чем и обусловлено их влияние на организм. Следовательно, вследствие отих процессов должна изменяться устойчивость нуклеиновых кислот. Поэтому возникает необходимость выяснения характера изменений термодинамических параметров, структуры и природы возможных изменений нуклеиновых кислот происходящих при вышеуказанных процессах. Подобного рода вопросы находятся сейчас в центре внимания, поскольку именно эта информация важна для понимания молекулярных механизмов 'функционирования нуклеиновых кислот, а также при разработки современных эффективных методов и средств терапии злокачественных новообразований. Исследование ус- . тойчивости комплексе з биологически активних веществ с нуклеиновыми кислотами актуально еще и тем, что анализ полученных данных позволит определить пути улучшения лекарственных препаратов, и, в частности, антираковых препаратов, способных эффективнее связываться с нуклеиновыми кислотами, а также понять молекулярный механизм их воздействия.
Следует- отметить, что выяснению термодинамики, структуры и природы взаимодействия нуклеиновых кислот с биологически активными веществами посвящено огромное количество экспериментальных и теоретических работ (Волькенштейн, Франк-Каменецкий, Гурский, Заседателев, Lerman , Waring и т.д.). В этих работах подробно исследовании комплексы нуклеиновых кислот с интеркаляторами и неинтеркаляторами и получены основные закономерности характеризующие их взаимодействия. Однако, сравнительно недавно были синтезированы новые типы противоопухолевых соединений, которые содержат плоские циклы (способные интеркалироваться) и длинные заряженные алифатические хвосты (способные электростатически взаимодействовать с фосфатными остатками нуклеиновых кислот). Физико-химические свойства комплексов таких соединений с правоспиральными и левоспиральными формами дву-спиральных нуклеиновых кислот почти не исследованы.
Возможные структурные изменения молекул ДНК, происходящие при опухолевой трансформации клеток приводят к изменению не только ее биологических функций, но и ряда ее физико-химических свойств. К
выявлению возможных изменений в молекулах ДНК при опухолевой трансформации клеток приковано внимание многих исследователей (Ванюшин, Нонаселидзе, Есипова, Жижина, Шугалий и т.д.). Генетическая близость нормальных и опухолевых клеток приводит к появлению трудностей в поиске различий между ДНК нормальных и опухолевых клеток. Эти различия исследованы как в аспекте первичной структуры, так и в физико-химическом плане. Однако эти исследования выполнены не совсем полно, не выяснена природа возможных структурных изменений, не определены места локализации и т.д. В частности, в некоторых работах (Ванюшин, Жижина и т.д.) показано увеличение содержания 5-ме-тилцитозина и выявлени участки с измененной структурой в ДНК опухолевых клеток по сравнению с ДНК нормальных клеток. Увеличение метилирования и появление участков с измененной структурой приводит к изменению устойчивости ДНК. Поэтому, исключительно актуальным является предложенный наш подход в применении дифференциальных кривых плавления для исследования вопросов устойчивости ДНК выделенных из опухолевых клеток, выявления участков с измененной структурой и исследования сравнительного влияния биологически активных веществ на ДНК опухоли и нормы.
Следовательно, разработка простых методов оі знки устойчивости нуклеиновых кислот при опухолевой трансформации клеток и при взаимодействии с биологически активными веществами вышеуказанного ти--па представляет собой весьма актуальную задачу, решение которой позволит, вероятнее всего, выявить новые закономерности в поведении термодинамических параметров при образовании комплексов нуклеиновых кислот с биологически активными веществами и ответить на многие вопросы, стоящие перед молекулярной биофизикой.
Цель и задачи исследования. Исследование устойчивости нуклеиновых кислот при взаимодействии с биологически активными веществами и при опухолевой трансформации клетки на основе разработки новых методических подходов.
В задачи работы входило: — при помощи спектрофотометрически полученных кривых плавления исследовать распределение нуклеотидов вдоль цепи молекулы ДНК, отличить ДНК различного происхождения, в том числе и опухолевую ДНК от ДНК нормы, разработать способ определения средних характеристик первичной структуры ДНК (среднее GC -содержание, дисперсию и т.д.), выяснить избирательность влияния биологически активных веществ на нуклеотидные пары;
с помощью оптических методов и микрокалориметрии исследовать термодинамику, конформацию и природу взаимодействия сравнительно недавно синтезированных противоопухолевых соединений содержащих плоские циклы и длинные заряженные хвосты (митоксантрон и аметан-трон) с двуспиральными природными и синтетическими нуклеиновыми кислотами, с опухолевой ДНК при различных ионных силах и температурах, а также их влияние на B^Z равновесие и термостабильность; с этой целью а) на первом этапе определено изменение термодинамических параметров при связывании классического интеркалятора бромистого этидия с синтетическими двуспиральными РНК; б) детально исследованы комплексы двуспиральных нуклеиновых кислот с митоксан-троном, аметантроном и нетропсином;
изучение влияние in vivo и in vitro различных биологически активных веществ на ДНК опухолевых клеток при помощи спектрофотомет-рически полученных дифференциальных кривых плавления.
Научное значение и новизна. В диссертации
исследовано распределение нуклеотидов вдоль цепи молекулы ДНК, дающее возможность отличить ДНК различного происхождения, в том числе и опухолевую ДНК от ДНК нормы, выяснить избирательность влияния биологически активных веществ на нуклеотидные пары и выявить структурные изменения в ДНК;
разрабртан новый метод определения средних характеристик первичной структуры ДНК (среднее 6С -содержание, дисперсия и т.д.) при помощи разложения дифференциальной кривой плавления на гауссовые составляющие;
обнаружено изменение термодинамических параметров и содержания 5-метилиитозина в ДНК опухоли по сравнению с ДНК нормы. Проанализирована причина этих различий и возможные структурные изменения в ДНК, происходящие при опухолевой трансформации клетки;
впервые экспериментально найдена сильная зависимость энтальпии связывания биологически активных веществ от степени заполнения нуклеиновых кислот, которая обнаружена для комплексов нуклеиновых кислот с аметантроном и митоксантроном;
впервые показано, что наличие двух последовательно расположенных нуклеотидов А и Т недостаточно для специфического взаимодействия нетропсина с В-формой ДНК;
предложен метод определения константы связывания биологически активных веществ с двуспиральными нуклеиновыми кислотами при слабом связывании, когда экспериментально невозможно фиксировать фи-
_ 4 -
зические характеристики полностью связанного состояния; — проведен термодинамический анализ комплексов биологически активных веществ с опухолевой ДНК, с природными и синтетическими нуклеиновыми кислотами по данным спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, микрокалориметрии и КД-спектрам, проанализирован вклад энтропии и энтальпии связывания в избирательность взаимодействия бромистого этидия, митоксантрона и аметантрона с нуклеотидными парами.
Практическая ценность. Полученные результаты могут быть применены в различных областях молекулярной биологии и медицины. Прежде всего, они представляют интерес для химиотерапии опухолей, при, разработке новых эффективных противоопухолевых соединений и поиске оптимальных путей направленного синтеза биологически активных соединений и экспресс-анализа их молекулярного действия.
Разработанный способ анализа дифференциальных кривых плавления уже используется в ИТОХ АН Армении для обнаружения структурных отличий в опухолевых ДНК и для характеристики эффективности противоопухолевых препаратов. Результаты работы испод!зуются в лекционных курсах по структуре нуклеиновых кислот в Еревак-зком государственном университете, в Триестском университете (Италия) и могут быть рекомендованы для учебных заведений, где есть специализации по биофизике и молекулярной биологии.
Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 56 печатных работах, включающих 26 статью в отечественных изданиях и 3 статьи в международных журналах.
Апробация. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзных совещаниях по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1977; Телави, IS80; Тбилиси, 1985); на Симпозиуме стран СЭВ по биофизике (Таллин, 1981); на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1977,1981,1984,1988,1991) на Симпозиуме стран СЭВ и СФРЮ "Гидратация биополимеров" '(Пущино,1987) на Всесоюзном совещании "Механизмы влияния электрического поля на свойства водных систем" (Киев, 1989); на международном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1987); на Всесоюзном совещании "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов (Рига, 1982); на III Всесоюзном совещании "Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей" (Черноголовка, 1987); на СССР-ЧСФР совещани-
ях - "Динамика и активность биологических макромолекул" (Вильнюс, 1984; Ереван, 1988); на международной школе по теоретической биофизике (Триест, 1986).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы (209 ссылок). Она содержит 227 страниц, в том числе 78 рисунков и 13 таблиц.