Введение к работе
Актуальность ьооблемы. Выяснение механизмов устойчивости
термофильных фотосинтетических организмов к действию высоких
температур . является одной из фундаментальных проблем в
исследованиях принципов стабилизации биологических систем. Ее
важное значение'обусловлено тем, что температура окружающей среды
относится к числу постоянно действующих природных факторов,
которые определяют эффективность и сек-'ношение различных типов
межмолекулярных взаимодействий, формирующих вг'триклеточные
системы . и организацию клетки в целом. Интерес к исследованию
термоустойчивости фотосинтетических организмов связан с
естественным ходом развития представлений і физико-хими^скях. основах внутриклеточного метаболизма, - интенсификацией биотехнологических исследований и другими многоплановыми задачами практического характера.
Первые реальные успехи в исследовании термофил: і были
достигнуты в 60-80 годах нашего столетия. Было показано, что
адаптация бактерий и растений к повышенным температуре , а также
переход от мезофильных к термофильным формам жизни бактерий и
водорослей сопровождается изменением липидного состава мембран и
повышением термоустойчивости белков. Общая термоустойчи"ость
клеток в первую очередь определяется структурной и функциональной
устойчивостью мембранных комплексов, в частности.
термоустойчивость клеток фотоавтотрофов зависит от устойчивости лшопротеиновых мембранных комплексов ФСІІ (см., например, Singleton and Amelunxen, 1973; Александров, 1975; Логинова, 1982; Qulnn and Williams, 1983; овразин и Можаев 1985). Благодаря дальнейшим детальным.исследованиям стали в основном понятными конкретные механизмы структурной термоустоичивости белков и принципы влияния температуры на фазовое состояние искусстввнь_к мембран, построенных из индивидуальных липидов. Показано огромное разнообразив структурных перестроек мембран, начиная от появления микрогетерогенного (кластерного) распределения липидов до полного нарушения ламеллярной организации липидного оислоя. Однако-, остается неясным вопрос о роли и взаимосвязи различных структурных изменений белковых и липидных компонентов в обеспечении
функциональной устойчивости биомембран. Выяснение этого вопроса
осложняется тем, что с помощью прямых традиционных методов
исследования конформациошшх перестроек липидныт систем
тврмоидуцировашгэ структурные сдвиги в липидном матриксе
биомембран удается уветенно обнаружить только на стадии их полной
фуь .циональной деградации. В то же время появляется все больше
косвенных данных о том, что значительные функциональные изменения
происходят уже на самых ранних стадиях изменения структуры мембран
(см., например, Hauvax and laimoye, 1985; .Terzaghi et al, 1989).
Например, исследуемое с помощью электронной микроскопии
термоинду дарованное расслоение липидов (образовав э гексагональной
фазы II) мембран хлоропластов начинает проявляться только после
того, как происходит полное разобщение миграции энергии со
светособирающих антенн на реакционные центры й ингибированив
электронного транспорта [Goimarie, at al., 19873. Таким образом,
центральным вопросом проблемы термоустойчивости фотоавтотрофных
организмов можно считать вопрос о роли начальных
твршиндуцированных структурных перестроек мембран * в
функциональных нарушениях цепи * транспорта электронов.
Перспективным подходом к решению, подобного рода задач является сочетание исследований температурных зависимостей функционального состояния цепи транспорта электронов и ее отдельных элементов, сопоставление этих . зависимостей с данными высокочувствительных методов изучения структурных переходов в биосистемах, а также выбор удачного об'єкта, позволяющего использовать сравнительный анализ температурной чувствительности функциональных компонентов мембран термофильных и мезофильных организмов.
Наиболее интересным об'єктом исследования явления термофялии фотоавтотрофных организмов, с нашей точки зрения, являются термофильные сине-зеленые водоросли (цианобактерии). Цианобактерии занимают промежуточное место в цепи эволюционного перехода от бактериального фотосинтеза к фотосинтезу высших растений. Структура их фотосинтетического аппарата имеет много общих черт как" с аппаратом бактерий, так* и высших растений. Это дает возможность при проведении исследований на цианобактериях, с одной стороны, опираться на обширный экспериментальный и теоретический материал, накопленный при изучении структурно-функциональных;основ
бактериального фотосинтеза, а с другой стороны, экстраполировать получае .їв результаты на высшие растения.
Вакно подчеркнуть, что среди цианобактерий существуют виты, которые обладают экстремальной термоустойчивостью и способны расти при предельных .пя фотоавтотрофных организмов температурах (70-73С). Исследование „мембран цианобактерий, относящихся к экстремальным термофилам, позволяет пидойти к р.шению вопроса о природе факторов, определяющих верхний предел температур роста, четп выраженный у фотоавтотрофных орган., jmob.
Высокой термоустойчивости биомембран, кг- правило, сопутствует и их- высокая устойчивость jc действию других физико-химических факторов. Поэтому, использование в качестве об'єкта исследований термофильных цианобактерий позволяет резко распг-рить. границы экспериментальных воздействий на об'єкт и использовать широкий арсенал методов анализа функционального состояния цепи транспорта электронов, в том числе чувствительные методы измерения спектральных характеристик v оценки скорости . эреноса электронов на искусственные акцепторы, изменение которых может быть опосредовано структурными изменениями в мембранах.
Цель и задачи исследования. Основная цель настоящего исследования состояла в выяснении природы структурно-функциональной устойчивости мембран термофильных цианобактетай к действию высоких температур.
Для достижения поставленной цели.в работе решались следующие экспериментальные задачи:
исследовать функциональную термоустойчивость различных участков ФОН - наиболее тешолабильного звена цепи транспорта электронов мембран термофильных цианобактерий;
провести сравнительное изучение физико-химических свойств . термолабильных и термостабильных участков ФСи цианобактерий и выяснить вклад различных механизмов структурной деградации липопротеиновых. комплексов в процесс тврмоинактивации переноса электронов в мембранах;
выяснить природу факторов, эффективно влияющих на . термоствбильность ФСІІ цианобактерий;
- исследовать структурно-функциональную термоустойчивость ФСІ
- термостабильного компонента цепи транспорта электронов мембран
термофильных цианобактерий и определить возможный характер факторов, ограничивающих верхний предел температур роста фотоавтотрофных организмов.
Научная ноілзна. В диссертационной работе на термофильных цианобактерях показано, что все звенья цепи переноса электронов ФС^і от водоразлагаюшего комплекса до первичного хинона обладают сравнительно высокой термостабильностью. Эта группа переносчиков прочно связана с полипзптидами реакционного центра, я их термоустойчивость, вероятно, обеспечивается устойчивостью самих полипептидов. Наибольшую термолабильность проявляют компоненты цепи транспорта электронов, расположенные на ш.депторной стороне ФОН цианобактерий. Они обеспечивают перенос электрона от хинона QA на QB и далее в пул пластохинонов. Основной причиной низкой термоустойчивости этого участка является расслоение липидов, приводящее, вероятно, к оттоку хинонов от реакционного центра.
Показана важная роль гидратации мембран в регуляции термостабильности липидзависимого участка ФСи изолированных мембран цианобактерий. На' основании результатов исследования действия на мембраны соединений, влияющих на состояние воды, высказано предположение, что роль регуляторов гидратации мембран в клетке могут выполнять полярные группы полипептидов, Сахаров и других соединений.
Впервые обнаружено явление термоиндукции рекомбинационной
замедленной лшинесцє -щи хлорофилла ФСІ цианобактерий и
хлоропластов высших растений. Термоиндукция послесвечения всі,
по-видимому, в значительной степени связана генерацией
триплетних состояний в рекционном центре и в аэробных условиях
сопровождается выцветанием хлорофилла и деградацией цепи траспорта
электронов. Результаты анализа природы этих процессов легли в
основу гипотезы о том, что верхний предел те.лервтуры роста
фотоавтотрофных организмов (70-73С) обусловлен
термоиндуцированной фотодинамической деструкцией пигмент-белковых комплексов.
Практическая значимость. Полученные в. работе
экспериментальные результаты и теоретические обобщения расширяют представления о механизмах теплового повреждения и регуляции термоустойчивости фотосинтетических мембран, что .может быть
использовано для це ленаправ пенного создания на основе изолирпа.нных мембранных комплексов устойчивых энергопреобразующих систем. Эти систем могут чуть использованы в различных областях биоэлектроники. Обнаруженный в работе эффект термоактивации послесвечения фотосистемы I может быть применен для исследования механизмов прямого и обратного переноса электронов в реакционном центре, а также для дифференциальной &лспресс-оц .ши стабильности различных фотосинтетических комплексов клеток растений и водорослей.
Разработаны методические подходы к получению функционально
активных устойчивых фотосинтетических комплексов,
реконструированных на основе искусственных лшидных матриц. Эти препараты отличаются высокой устойчивост' ю и могут быть. использованы для исследований о помощью методов, требующих ^жесткой" подготовительной обработки об'ектов. В частности, цротеолипосош с нат,*вными комплексами фотосистемы и цианобактерий были'с успехом использованы для прямой регистрации фотопотенциала электродным методом.
Результаты работы и разработанные методики исполтчуются при выполнении научно-исследовательских- работ в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ и Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН.
Отдельные разделы работы используются в курсе лекций "Молекулярная организация биологических мембран" и на практикуме по биофизике Биологического факультета МГУ.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на
Всесоюзных и Международных конференциях и с'ездах: 1 Всесоюзный
риофизический с'езд (Москва, 1982), 1 Всесоюзная конференция
"Кинетика и механизм электронного переноса в белковых системах и
их моделях" (Вильнюс, 1985), 1 Болгаро-Советский симпозиум
"Свободные радикалы и биостабилизаторы" (София, 1987), 12 Всесс з-вое совещание по транспортным АТФазам "Ионный гомеостаз и влияние различных факторов внешней среды на жизнедеятельность клетки" (Иркутск, 1987), Совещание- семинар по молекулярной биофизике (Воронеж, 1987), 6 конгресс федерации европейских обществ физиологов растений (Югославия, Сплит, 1988), 3 конгресс европейских обществ фотобиологов (Венгрия, Сегед, 1989), Международный кон-
гресс по применению Мессбауэровского эффекта (Венгрия, Будапешт» 1989), 2 Всесоюзный сезд физиологов растений (Минск, І 990).-
Заключительный этап работы проводился по гранту Министерства науки, высшей голы и технической политики России N 180-101-93.
Структура и об'єм диссертации. Диссертационная работа
В1 лнает в себя следующие основныь разделы: "Введение", "Обзор литературы" (2 главы), "Материалы и метода исследований" (3 главы), "Результаты и их обсуждение" (5 глав), "Выводы" и список литературы. Общий об'єм работы составляет 248 стр., в том числе 77 рисунков и 8 таблиц.
Методические аспекты работы. В качестве об*'ктов исследования
бЫЛИ ИСПОЛЬЗОВаНЫ КЛеТКИ ТерМОфИЛЬНЫХ ЦИаНОбакТерИЙ Synechoooooue
oiongatua (оптимальная температура роста в лабораторных условиях
Б5С) и получаемые из них фотосинтетические мембраны, частицы.
ФСіхс активной кислородвыделяющей системой и фрагменты мембран,
обогащенные ФС1 [Кауров я др. 1986]. Культура клеток s.eioneotue
(N120, музей института физиологии растений им.К.А. Тимирязева РАН)
была любезно предоставлена Владимировой М.Г. В сравнительных
экспериментах использовали хлоропласти гороха, которые выделяли да
методу, описанному в работе [Семин и др., 1986]. Суммарные
галактолипиды из клеток цианобактерий получали согласно методу
[van Valraven et"al., 1984]; лецитин выделяли из желтков куриных
яиц [Pangbom, 1951]. В качестве источника пластохинона
использовали лиофилиз'тюванные . хлоропласта шпината [Сох and
Bendall, 1974]. \
Решение поставленных в работе задач потребовав привлечения широкого набора физико-химических, биофизических и биохимических методов, основные из которых перечислены ниже.
Мембраны, частицы ФСІІ с активной кислородвыделяющей системой
И МембраННЫв КОМПЛеКСЫ ФСІ ИЗ КЛетОК Synecho, icoua elongatue
получали с помощью методов описанных в работах [Кауров и др. 1986, 1988].
Скорость выделения и поглощения кислорода мембранными препаратами определяли амперометрически с помощью электрода Кларка.
Стационарные и динамические оптические характеристики прымратов исследовали при комнатной температуре и температуре
жидаого азота на спектрофотометрах СФ-10, Hitaohi - 557 и спектро'луориметре MPF-2A.
Содержание рьакционшс центров ФСІ оценивали с помг-'ью дифференциальных спектров "окисленный минус восстановленный" [Hiyama and . Ке,, 1972]. Концентрацию Р680 измеряли по фотоиндуцированному восстановлению феофитина в присутствии дитионита и метилвиологена [Klimov et al., 1980].
Регистрацию сигнала ЭПР от промежуточного донора z в частицах ФС1Т проводили на радиоспектрометре ^ЛР-РЭ-130.
Быструю кинетику абсорбционных изменений препаратов исследовали на дифференциальном спектрофотометре, соединенным с регистратором переходных процессов DL 1080 (Англия).
Измерение трансмембранного фотоиндуциров^нного потенцигпа в. реконструированных липопротеиновых частицах ФСІІ проводили по методу, предложенному Драчевым [Draohev et al., 1988, 1989].
Калориметрические исследования были выполнены о помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-1М.
Мессбауэровские : спектры регистрировали на установке "мессбауэровсквя лаборатория" с анализатором ИТА-1024.
Замедленную люминесценцию регистрировали с помощью фотометрической установки, сконструированной на базе фосфороскопа со временным разрешением 1,5 мс. Кинетику затухания миллисектадной компоненты послесвечения регистрировали с' помощью дискового Фосфороскопа.