Упругие свойства белковых кристаллов и липидных везикул в различных условиях Пожарский, Эдвин Владимирович

Введение к работе

Актуальность темы.

Упругие свойства твердого тела прямо связаны с подвижностью частиц, его составляющих. Поэтому, изучая упругие свойства белковых кристаллов, можно получить информацию о влиянии различных физико-химических факторов на общий уровень подвижности белковых молекул. Хорошо известно, что динамика белка прямо связана с его функциональными свойствами. Таким образом, актуальность темы данной работы обусловлена важностью решения фундаментальной задачи о взаимосвязи механических и функциональных свойств белковых молекул.

Многолетние исследования В.Н.Морозова с сотрудниками показали, что упругие свойства различных белковых кристаллов подчиняются общей закономерности. Модуль Юнга белковых кристаллов убывает линейно в широком диапазоне температур. Экстраполяцией модуля Юнга к нулю можно получить температуру потери белковым кристаллом механической стабильности Т_т. Оказалось, что Г_ш, во-первых, лишь ненамного превышает температуру денатурации, что отличает белковый материал от обычных материалов, для которых температуры плавления и потери механической стабильности отличаются на сотни градусов. Как показано в работе [28], термодинамически это означает высокую степень энтальшшно-энтропийной компенсации процесса деформирования в широком диапазоне относительных деформаций. Во-вторых, Т_т для ряда белковых кристаллов одинакова и равна примерно 80 С, то есть является универсальной характеристикой белкового материала.

Возникает вопрос, не означает ли это, что в белковом кристалле есть некая наиболее мягкая мода и что описанная закономерность является особенностью лишь этой мягкой моды, а не белкового материала в целом. Попытка приблизиться к ответу на этот вопрос представлена в настоящей работе.

Нативная молекула белка in vivo находится в водном окружении. Как показано в ряде работ [19,25,29], вода служит «катализатором подвижности» белка. Задача выяснения конкретного физического механизма влияния водного окружения на внутримолекулярную подвижность далека от решения. Ранее было показано [25], что высушивание белковых кристаллов приводит к значительному увеличению жесткости и росту температуры потери механической стабильности Г_т. Но при таком способе дегидратации происходит сильная структурная перестройка белка [22]. Необходимо проверить эти результаты при другом, более мягком способе обезвоживания, например, путем переноса в безводный растворитель.

Другой важный аспект взаимодействия белковой молекулы с водным окружением связан с процессами обмена, когда молекула воды диффундирует из объема растворителя внутрь белковой глобулы. Термодинамика этого процесса исследуется в настоящей работе в разделах, посвященных изотермам гидратации расплавленной глобулы и моделированию водородного обмена.

Исследование кинетики фазовых переходов в биополимерах представляет интерес ввиду их несомненного функционального значения. Для фазовых переходов первого рода, какими являются денатурация белка и плавление липидных мембран, кинетика всего перехода определяется кинетикой образования зародыша новой фазы в ходе гетерофазных флуктуации. Теоретическая разработка

вопроса о вкладе энергии упругой деформации в свободную энергию образования зародыша предпринята в настоящей работе. Результаты расчетов апробируются на случае главного фазового перехода в липидных мембранах.

Цель и задачи работы.

Основные цели настоящей работы следующие:

1. Исследование связи упругости и динамики белка в кристалле.

2. Исследование взаимосвязи между гидратацией и упругими свойствами белков.

3. Исследование роли упругой деформации в кинетике зародышеобразования.

В связи с этим решались следующие конкретные задачи:

1. Разработка нового подхода к изучению упругих свойств белковых кристаллов, основанного на измерении температурной зависимости интенсивности рентгеновской дифракции.

2. Разработка магнитного микрометода измерения модуля Юнга.

3. Разработка микрогравиметрического метода измерения изотерм гидратации белковых пленок.

4. Исследование температурной зависимости интенсивности рентгеновской дифракции тетрагональными кристаллами лизоцима.

5. Исследование температурной зависимости модуля Юнга тетрагональных кристаллов лизоцима при связывании ингибитора (аналога субстрата) - Ы-ацетил-Б-глюкозамина.

6. Исследование модуля Юнга и его температурной зависимости для триклинных кристаллов лизоцима в условиях безводного ацетонитрила и в смеси вода-ацетонитрил.

7. Получение изотерм гидратации а-лактальбумина человека в нативном состоянии и в состоянии расплавленной глобулы.

8. Разработка модели водородного обмена в белках [17], в которой в явном виде учитываются энергии упругой деформации и электростатического взаимодействия как основные факторы, определяющие кинетику обмена.

9. Разработка такой модели зародышеобразования при фазовом переходе первого рода, в которой учитывался бы вклад упругой деформации. Апробация модели на случае гетерофазных флуктуации, сопровождающих фазовый переход в липидных мембранах дипальмитоилфосфатидилхолина.

Научная новизна.

Показано, что размягчение белкового кристалла при нагреве нельзя свести к размягчению отдельно взятых мод трансляционного движения глобулы как целого или внутримолекулярной моды взаимного движения доменов. Вероятно, в кристалле происходит пропорциональное увеличение амплитуд колебаний всех основных мод внутримолекулярного движения и движения как целого.

Показано, что замена водного окружения безводным
растворителем (ацетонитрил) меняет термодинамику

деформирования так же, как это происходит при дегидратации высушиванием. По-видимому, в обоих случаях изменения динамики белка определяются именно снижением активности воды.

Впервые получены изотермы гидратации белка в состоянии расплавленной глобулы, из которых следует, что молекулы воды стехиометричсски связываются внутренними атомными группами белка.

Впервые количественно показано, что индивидуальные вариации скоростей водородного обмена внутренних атомных групп нативных белков определяются двумя главными факторами: упругой деформацией и электростатическим взаимодействиями при проникновении иона-переносчика из растворителя в белковую глобулу.

Практическое значение работы.

В рамках нового рентгеновского подхода к исследованию упругих свойств белковых кристаллов возможна оценка средней подвижности и определение параметров движения белковой глобулы как целого. Объем измерений при этом сокращается на два порядка по сравнению с традиционной рентгеновской процедурой.

Новый магнитный микрометод измерения модуля Юнга может применяться не только к белкам, но и к другим полимерным материалам. По сравнению с предложенными ранее методиками ([21,25,27]) он обладает более высокой точностью измерений, включает относительно простую процедуру приготовления образцов, позволяет проводить измерения в капле раствора.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались: на семинаре лаборатории физической биохимии РГТЭБ РАН; на Институтской научной конференции ИТЭБ РАН (Пущино, 1997);

на Юбилейной научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальной и прикладной физики и математики» (Долгопрудный, 1997);

на 11-ой международной конференции "Surface Forces" (Москва, 1996);

на 6-ой международной биофизической летней школе "Supramolecular structure and function" (Ровинь, Хорватия, 1997);

на летней школе "Physics of Molecular Biology" (Хумлебек,
Дания, 1998); ~

на международной конференции по физической метрологии "Fizmet'98", (Санкт-Петербург, 1998);

' на 1-ой, 2-ой и 3-ей Путинских городских конференциях молодых ученых (Пущино, 1996-1998).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ (4 статьи и 11 тезисов докладов).

Структура и объем диссертации.