Введение к работе
Актуальность проблемы. Актуальной задачей молекулярной иммунологии является выяснение механизма взаимодействия антитела с антигеном и передачи информации о связывании антигена из Fa»-фрагмента молекулы антитела через несколько структурных доменов в F0-фрагмент. Существует мнение (Pecht,l983 . Zavodszky, 1981, 193), что передача информации на большие расстояния в антителах связана с "дыхательным" движением глобулы молекулы, вызванным кооперативным разрывом и восстановлением внутримолекулярных взаимодействий в процессе теплового движения атомов. Информацию о динамических свойствах и устойчивости системы можно получить из определения флуктуации ее макроскопических термодинамических параметров. Так, в частности, по величине сжимаемости J3 - -(1/VK o"v/ 6Р), определяемой из измерений скорости распространения ультразвука и плотности (J3 - 1/pU2), можно непосредственно судить о тепловых флуктуациях объема 6V и внутримолекулярной подвижности молекулы антитела и её комплекса с антигеном ( 5V = j)TkVT, где к - постоянная Больцмана, V - объем, Т -. температура, Р - давление ).
Важным аспектом, определяющим дальнейшее развитие иммунологии и иммунологических методов исследования, является разработка новых физико-химических методов детекции реакции взаимодействия антиген-антитело, отличающихся экспрессностью, чувствительностью, возможностью' проведения анализа без выделения очищенных антигенов и антител. Одним из таких методов является акустический , основанный на прецизионных измерениях скорости распространения ультразвуковых волн. Метод характеризуется широким интервалом определяемых концентраций вещества, возможностью с одинаковым успехом анализировать как чистые, так и мутные (окрашенные) биологические жидкости, полной автоматизацией анализа.
Цель работы. Используя акустический метод, изучить характер конформационных перестроек в антителах после связывания антигена, выяснить роль внутримолекулярной подвижности антител в их функционировании и разработать основные принципы акустической детекции в различных вариантах иммуноанализа.
Основные задачи: определение объемно-упругих свойств антител; изучение влияния различных физико-химических факторов (температуры, рН ) и специфического связывания с антигенами на упругие свойства антител и их Fab-фрагментов; разработка меа?дических подходов акустической детекции реакции антиген-антитело прямым и иммуноферментным способом.
Научная новизна. Определены инкременты скорости распространения и коэффициента поглощения ультразвука, а также кажущаяся сжимаемость молекул IgG ряда животных и оценен вклад основных составляющих этих параметров. Изучено Елияние температуры и рН среды на акустические и упругие свойства IgG. Оценены изменения внутримолекулярной подвижности антител при образовании растворимых иммунных комплексов и нерастворимого надмолекулярного агрегата. Изучена роль конформационных перестроек б антителах, вызванных связыванием с антигеном и гаптеном. Показана возможность количественного определения антигенов по регистрации скорости ультразвука при иммунохимических взаимодействиях. Определены основные принципы акустической детекции ферментативных реакций и показана возможность использования акустического способа для регистрации результатов гомогенного иммуноферментного анализа.
Практическая значимость. Полученные в работе результаты могут послужить основой для широкого использования акустического метода в молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии. Разработаны методики количественного определения антигенов и активности ферментов по регистрации скорости ультразвука, отличающиеся высокой чувствительностью, специфичностью и экспрессностью, которые внедрены в Самаркандском медицинском институте.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Путино. 1985), на Международном симпозиуме "Ультразвук в биологии и медицине" УБИОМЕД-Ш (Айзенах, ГДР, 1986), УБИОМЕД-YIІГ (Прага, ЧССР, 1989), на 5 Есеооюзном биохимическом съезде (Москва, 1986), на II Международной школе-конференции молодых ученых социалистических стран "Молекулярные основы биотехнологии" (Пущино, 1987), на конференции "Молодые ученые и специалисты - ускорению социально-экономического развития" (Самарканд, 1988), на Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Москва, 1990).
По результатам диссертации опубликовано 17 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов работы и их обсуждения (две главы), выводов и списка литературы (186 источников). Работа содержит 6 таблиц й 30 рисунков. Материалы изложены на 127 страницах машинописного текста.