Введение к работе
Актуальность проблемы., Согласно хемиосмотической теории Митчелла (Mitchell , 1961, 1966, 1968, 1974, 1979), первичные системы, которые способны извлекать энергию из энергетически богатых соединений, генерируют разность электрохимических потенциалов для ионов водорода. Затем, энергия, накопленная в электрической и осмотической форме, используется вторичными транспортными системами для совершения той или иной полезной работы (Николе, 1985; Скулачев, 1989). Взаимосвязь первичной и вторичной систем осуществляется косвенно через делокализован-ный электрохимический градиент, ионов водорода.
Вместе с тем, в последние годы появилось множество экспериментальных данных, которые не укладываются в рамки хемиосмотической теории ( Bourd, Martirosov , 1983; Воуег , 1984; Ferguson, 1985; Robillard, Konings , 1982; Slater et 81^1985; viilliams , 1988). Приведем три примера, относящиеся к экспериментам на бактериях.
Количественный анализ связи между электронтранспортной цепью, протондвижущей силой и транспортом ионов в бактериях показал, что поглощение некоторых веществ не может иметь место без функционирования электронтранспортной цепи, даже в условиях когда имеется значительный электрохимический потенциал ионов водорода (Elferink et al. , 1985). Более того, несмотря на падение величины &jUjj+, наблюдалось увеличение накопления веществ (Elferink , 1986).
У алкалофильных бактерий величинаД|Цц+ значительно ниже того значения, которое необходимо для фосфорилирования ( Guf-fanti et al. , I98I;Krulwich , 1986; Krulwich, Guffanti, 1989). Тем не менее, при работе' дыхательной цепи наблюдается синтез АТФ, который требует лишь циркуляции ионов Н* через мембрану, хотя некоторая величина Д/К м+ все же необходима (Guffenti, Krulvdch , 1988). Создается впечатление, что элек-тронтранспортные цепи могут вступать в прямой контакт с вторичными транспортными системами.
У ряда анаэробно выращенных бактерий установлено, что две генетически независимые мембранные системы Н^-АТФаза FqP-j и
І^-транспортер Тл?к -система объединяются в суперкомплекс,функционирующий как H^-K^-Hacoc (Bourd, Martirosov » 1983; Durga-ryan, Martirosov , I978a-CJ Martirosov, Trchounian , 1982). Внутри такого суперкомплекса часть энергии гидролиза АТФ от 1Г-АТФазы ?0F1 должна передаваться, прямо на Trk -систему, чтобы обеспечить градиент по К* в 2-Ю .
Формирование суперкомплексов из отдельных мембранных систем является, по-видимому, общим свойством сопрягающих мембран бактерий ( Bourd,Martirosov , 1983). Переносчики Сахаров, такие как фосфоенолпируват-фосфотрансферазная система (ФТС) и лактозная пермеаза, а также аденилатциклаза, могут попарно образовывать суперкомплексы; в этом случае функционирование одной системы тормозит работу другого механизма и за счет этого достигается регуляция метаболизма клетки. Некоторые авторы склонны считать даже, что такие огромные и сложные мультифер-ментные системы как гликолиз или цикл трикарбоновых кислот работают как отдельные пространственно ориентированные структуры (Любарев, Курганов, 1989; IiyuDarev, Kurganov , 1989).
Несмотря на значительное количество экспериментальных да~~ казательств, собранных в течение десяти лет Мартиросовым с сотрудниками (Мартиросов, 1985; Bourd, Martirosov , 1983; Martirosov, Trchounian , 1983, 1986) о возможности образования ионного транспортного суперкомплекса у анаэробно выращенных бактерий, тем не менее остался ряд принципиально важных вопросов, без которых проблема прямой передачи энергии между двумя белками оставалась по-прежнему неясней.
Обычно передача энергии в энергосопрягающих мембранах сопряжена с передачей восстановительных эквивалентов от к акцептору. Например, в дыхательной или фотоиндуцируемой цепи. Было ясно, что ни Н^-АТФаза рл^ , ни irk -система не являются носителями окислительно-восстановительных локусов, таких как, скажем в хинонах или цитохромах.
Поэтому прямое взаимодействие двух транспортных белков без участия редокс элемента казалось сомнительным, и незримо стоял вопрос: а нет ли в процессе взаимодействия Н^-АТФазы F^ и Trk-белком третьего участника, обеспечивающего эти системы восстановительными эквивалентами? И второе, какие лиганды могли бы слу-
жить акцепторами или донорами восстановительных эквивалентов на транспортных белках?
Далее, в гипотезе, предложзнной Мартиросовым с сотрудниками, утверждаемся, что энергия от Н^-АТФазы Fq^I к ^^-системе передается прямо. Это означает, чтодМ^+ не может служить энергетическим посредником в таком взаимодействии. Тем не менее, эксперименты показывают, что без &/Wtf+ поглощения К*" не наблюдается ( Martirosov, Irchounian. , 1986). С другой стороны, ра- бота суперкомплекса IfqP^ - й?к| определяется стехиометрическим соотношением АТФ:2Н+:іГ" ( Durgaryan,-Martirosov , 1978 ; Martirosov , Trchounian , 1982), что подразумевает перенос через Н*-насос i^f^ двух ионов водорода. Это противоречило хорошо известным термодинамическим расчетам о том, что стехиометрия ї1,^ определяется отношением АТФ/ЗН* при фосфатном потенциале равном 52 кДж/моль идДл+ равном 17 кДж/моль (Николе, 1985; Ferguson, Sorgato , 1982; Kashket , 1983). Без понимания механизма прямой передачи энергии невозможно ответить на изложенные выше вопросы.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось выяснение механизма прямой передачи энергии внутри ионного транспортного суперкомплекса р,-^-фгк} у анаэробно выращенных бактерий Escherichia coli . Нами были приняты к исследованию следующие задачи:
-
Установить природу донора восстановительных эквивалентов, участвующего во взаимодействии Н^-насоса FqF^ и К^-транс-портера Trk -системы у анаэробно выращенных E.coli.
-
Провести сравнительный анализ характера связи между деятельностью протонно-калиевого насоса и редокс-состоянием мембран мутантных штаммов E.coli , дефектных по калиевому транспорту или функциям Р^^ Н^АТФазы.
-
Определить роль Д/!(.[{+ в функционировании транспортного суперкомплекса и природу функциональных групп, участвующих в процессе передачи энергии между системами, формирующими суперкомплекс.
-
Попытаться построить количественную модель ионного транспортного суперкомплекса, которая объясняла бы механизм взаимодействия первичной и вторичной транспортных систем.
Научная новизна и научно-практическая ценность работы. В
результате проведенных нами исследований впервые показано, что в процессе протонно-калиевого обмена у анаэробно выращенных бактерий Escherichia coli участвует мембранно-связанный мультифер-ментный комплекс формиат-водород-лиаза, осуществляющий производство молекулярного водорода у этих микроорганизмов. Использование окислителей и восстановителей, а также мутантов с дефектом по транспорту калия или Ґ-АТФазе PqP^ позволило установить центральное место тиоловых групп белков в ионном обмене.
В работе показана важность электрохимического градиента ионов водорода (д Ш ^) в формировании редокс-профиля тиоловых групп для реализации активности переносчика, и установлено, что в качестве регулятора редокс-состояния тиоловых групп белков в отсутствие A/Mw*- может выступать восстановитель - дитиотреитол.
Впервые удалось использовать платиновый электрод в комбинации со стеклянным титансиликатным электродом для обнаружения в экспериментальной среде молекулярного водорода, что позволило дифференцировать истинные значения редокс-потенциала от "артефакта", создаваемого молекулярным водородом.
Совокупность экспериментальных данных, полученных в настоящей работе, сделала возможным создание количественной модели ион> ного транспортного суперкомплекса, объясняющего механизм передачи энергии и восстановительных эквивалентов с помощью формиат-водород-лиазы в процессе взаимодействия двух транспортных белков
Результаты исследований позволяют сделать как частные выводы, важные для биофизики и биохимии микроорганизмов, так и обсудить общебиологические аспекты передачи энергии без посредничества дШ ^+. Полученные данные могут быть использованы для повышения эффективности применения бактерий в биотехнологии.
Апробация работы. Основной материал диссертационной работы обсуждался на научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета Ереванского госуниверситета.
Результаты исследований доложены на У-ой Всесоюзной Межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), на Всесоюзном совещании "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино, 1988), на Ш-ей Республиканской конференции аспирантов Арм.ССР, посвященной 70-летию BJttCM (Ереван, 1989), на Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических
мембранах" (Кара-Даг - Пущино, 1989).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 5 статей.
Объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 25 рисунков. Библиография включает 188 наименований литературных источников, в том числе 142 на иностранном языке.
Структура диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав: I - обзор литературы, П - материалы и методы исследований, Ш - результаты исследований, ІУ - обсуждение результатов; выводов и списка использованной литературы.