Триплетные состояния фотосинтетических пигментов in vitro и in vivo Проскуряков, Иван Игоревич

Введение к работе

Постановка проблемы, ее актуальность. Фотосинтез является одним из важнейших биосферных процессов на Земле. В результате его протекания энергия солнечного гвета используется для синтеза органических веществ. Іосле поглощения света молекулами пигментов, входящих в состав фотосинтезирующих организмов, происходит быстрый процесс межмолекулярного переноса энергии. При попадании возбуждения на пигменты специализированных пигмент-пипопротеиновых структур (реакционных центров, РЦ¹), запускается цепочка реакций переноса электрона между его компонентами. Конечные стадии функциональных процессов в РЦ имеют высокий квантовый выход (~ 100%) и энергетический к.п.д. (0,5 - 0,6).

Исследования общих принципов структурной организации и механизма первичных стадий фотосинтеза имеют большое значение как для понимания самого процесса фотосинтеза, так и для создания работающих на сходных принципах высокоэффективных фотопреобразователей. Кроме этого, они являются важным звеном изучения общих закономерностей фотохимических и фотофизических процессов.

Еще в 1936 г. Гаффрон и Воль высказали предположение, что основной пигмент фотосинтеза, хлорофилл, в метастабильном состоянии может играть роль сенсибилизатора фотохимических реакций. Это предсказание в полной мере оправдалось в случае фотохимических реакций хлорофилла in vitro. В работах ряда авторов (Франк 1953, 1957,1964, Робинсон 1963,1967, Фонг 1974,1976,1977) триплетному состоянию хлорофилла отводилась ключевая роль и в процессе фотосинтеза. Такие свойства триплетов, как большое время жизни возбужденного состояния и высокая реакционноспособность были сочтены подходящими для осуществления фотореакций in vivo.

Представления о роли триплетных состояний коренным образом изменились после того, как стали возможны оп-

Сокращения: АДМР-абсорбционно-детектируемый магнитный резонанс; МОДС-магнитооптическая дифференциальная спектроскопия; МФС-магнитофотоселекция; ОДМР-оптически детектируемый магнитный резонанс; РИДМР-Reaction Yield-Detected Magnetic Resonance; РНП-расщепление в нулевом поле; РП-радикальная пара; РЦ-реакционный центр; СВЧ-сверхвысокая частота; ЭПР-электронный парамагнитный резонанс; MIA-Microwave-Induced Absorbance changes.

тические измерения с пикосекундным временным разрешением. Было показано (Кауфманн 1975, Рокли 1975), чт< первая приводящая к относительно стабильным продукта» стадия фотопереноса электрона в бактериальных РЦ завершается за время ~ КГ¹¹ с. Поскольку при поглошениі кванта света пигменты фотосинтеза переходят в синглет-ное возбужденное состояние, и на переход молекул і триплетное состояние обычно необходимо время ~ 10'⁸ с, гипотеза об участии триплетов в фотосинтезе была отвергнута .

Современный взгляд на механизм первичных стадий фотосинтеза отводит триплетным состояниям пигментов ролі побочных, эффективно заселяемых лишь при нарушении нормального электронного транспорта. Тем не менее, триплетное состояние пигмента представляет собой почта идеальную спиновую метку, которую можно использовать для исследования структуры и функции фотосинтетическогс аппарата. При создании такой метки сохраняется нативное окружение, она чувствительна ко взаимодействиям с окружающими молекулами. Очень важно, что в триплетные состояния переходят те же молекулы, которые участвуют і функциональном переносе энергии и электрона. Далее, триплетное состояние чувствительно к магнитным взаимодействиям, которые невозможно исследовать методам* оптической спектроскопии и которые играют важнейшук роль в процессе переноса электрона. Магнитное диполь -дипольное взаимодействие между неспаренными электронам* триплетного состояния зависит от расстояния между спинами приблизительно как г~³. Поэтому даже небольшие вариации расстояния могут отражаться на спектроскопических параметрах триплетов. Это позволяет надеяться на возможность обнаружения распределения свойств триплет-несущих молекул. К недостаткам, скорее не собственно триплетних меток, а методов их исследования, существовавших к моменту начала данной работы, следует отнести то, что регистрация триплета магниторезонансны-ми методами требовала охлаждения образцов до низки* температур (~10 К).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в исследовании свойств триплетных состояний фотосинтетических пигментов in vitro и in vivo, а также и> предшественников, и получение на этой основе новой информации о механизмах переноса энергии и электрона е бактериальном фотосинтезе и в фотосистеме II высшиг растений.

В связи с этим в работе были сформулированы следую-;ие экспериментальные задачи:

1) разработка методов исследования триплетных со-
тояний и их предшественников в возможно более широком
иапазоне температур и с достаточно высоким Еременным
азрешением;

1. изучение механизмов заселения триплетных состоя-ий in vitro и in vivo;

2. поиск проявлений распределения свойств (неодно-одности) исследуемых фотосинтетических препаратов;

3. поиск подходов к изучению магнитных взаимодейст-ий предшественника триплетных состояний в фотосинте-ических РЦ;

5} изучение механизма триплет-триплетного (Т-Т) пе-еноса энергии в бактериальных РЦ;

6) исследование причин существенных различий войств триплетных состояний в бактериальных РЦ и реак-ионных центрах фотосистемы II.

Научная новизна и практическое значение работы. ольшинство научных и методических результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный арактер. Предложенный метод регистрации влияния маг-итного поля на выход флуоресценции способствовал тановлению представлений о первичной радикальной паре, Р⁺1~] (см. рис. 2), как предшественнике триплетного со-тояния первичного донора РЦ, и о существовании флуо-есцентного канала рекомбинации этой радикальной пары, существленное впервые прямое детектирование первичной адикальной пары в бактериальных РЦ методом ЭПР позво-ило однозначно определить величину и знаки магнитных заимодействий между ее компонентами. Это в свою чередь дало дополнительные свидетельства в пользу по-ледовательного механизма переноса электрона в РЦ.

Впервые сконструированный в нашей стране (и один из учших в мире на момент создания) автоматизированный пектрометр флеш-ЭПР позволил расширить температурный иапазон измерений спектров ЭПР триплетных состояний отосинтетических пигментов до комнатной температуры, лагодаря этому удалось наблюдать ранее неизвестные из-енения в триплетном спектре Rb.sphaeroides, которые ыли интерпретированы как проявление первой стадии Т-Т ереноса энергии на каротиноид РЦ. Полный процесс пере-оса был затем также изучен методом флеш-ЭПР; родемонстрировано выполнение в процессе Т-Т переноса нергии правила сохранения проекции спина на внешнее

4 магнитное поле. Температурная зависимость триплетногс спектра ЭПР Rps.viridis позволила высказать предположение о релаксации спиновой поляризации триплете первичного донора РЦ, индуцированной магнитным взаимодействием с комплексом первичного акцептора электрона. Методом АДМР впервые продемонстрировано распределение свойств триплета первичного донора в РЦ Rb.sphaeroidei R26. Неоднородность обусловлена вариацией расстояни; между половинами димера и соответствующими изменениям* в величине экситонного взаимодействия между ними.

Флеш-ЭПР исследования триплетов хлорофиллов іл vitro показали, что их параметры РНП изменяются і зависимости от свойств растворителя и могут достигать значений, характерных для триплетного состояния первичного донора фотосистемы II (³Р680). Проведенные впервые измерения спин-решеточной релаксации ³Р680 позволил* дать объяснение отмеченному ранее исчезновению сигнале ЭПР этого триплета при температурах Т > 30 К. Методов флеш-ЭПР удалось исследовать спектры ЭПР ³Рб80 в широко* температурном интервале, вплоть до Т = 230 К. Предложенная модификация метода магнитофотоселекции (МФС) дала возможность регистрировать сигналы при низких ин-тенсивностях возбуждающего света. Полученные этим методом данные позволили определить знаки параметров PHI ³Рб80. Сопоставив свойства Р680, обнаруженные в экспериментах по МФС, и температурную зависимость релаксации, мы предложили первую детальную модель структурной организации первичного донора фотосистемы II.

Разработанные экспериментальные методики, подходы, установки продолжают использоваться в ИПФС РАН (Пущино) и Лейденском университете (Нидерланды). Многие из полученных результатов имеют принципиальное значение дл* понимания механизмов переноса энергии и электрона в фотосинтезе.

Основные научные результаты работы.

1. Показано, что флеш-ЭПР спектроскопия триплетныз состояний фотосинтетических пигментов и их предшественников служит эффективным методом исследования первичны: процессов фотосинтеза. Применяемая в этом методе быстрая регистрация фотоиндуцированных сигналов позволяем судить об их начальной спиновой поляризации и во многи: случаях дает возможность резко расширить допустимы! температурный диапазон измерений по сравнению со стандартным стационарным методом ЭПР. С помощью параметрої РНП триплетного состояния можно проводить его идентифи-

5 ацию. Изучение формы спектра и релаксационных свойств риплетных состояний дает информацию о магнитных взаи-юдействиях и динамических характеристиках триплетов.

2. Характер начальной спиновой поляризации спектра ПР триплетного состояния несет информацию о механизме го заселения. По виду поляризации легко различать три-летные состояния, образовавшиеся в результате екомбинации триплетных радикальных пар, прямого интер-омбинационного перехода, синглет-триплетного деления озбуждения или Т-Т переноса энергии.

3. Установлено, что димерная организация первичного ;онора электрона в реакционных центрах фотосинтеза яв-яется универсальной, характерной для всех известных ипов реакционных центров. Такая организация позволяет согласовать требуемые оптические и окислительно-осстановительные свойства первичного донора.

4. На примере триплетного состояния первичного до-ора бактериальных РЦ продемонстрировано наличие аспределения свойств этих фотосинтетических объектов, днное наблюдение скорее всего носит общий характер, и озможность распределения кофакторов РЦ по расстояниям

взаимным ориентациям необходимо учитывать при разра-отке моделей, описывающих их свойства.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на Всесоюзном сове-ании по люминесценции (1979 г., Самарканд), V сесоюзной конференции "Использование вычислительных ашин в спектроскопии молекул и химических исследо-аниях" (сентябрь 1980 г., Новосибирск), III Всесоюзной онференции "Поляризация электронов и ядер и магнитные ффекты в химических реакциях" (август 1981 г., овосибирск), Симпозиуме специалистов стран-членов СЭВ Исследование биогенеза, структуры и функции отосинтетического аппарата в связи с преобразованием олнечной энергии" (1981 г., Пущино), Всесоюзном овещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии его аппаратурное обеспечение" (декабрь 1981 г., ига), Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в сследовании химических элементарных актов" (сентябрь 984 г., Новосибирск), Всесоюзной конференции "Кинетика механизм электронного переноса в белковых системах и х моделях" (апрель 1985 г., Вильнюс), Всесоюзной онференции "Физико-химическая биология и биотехнология ототрофных микроорганизмов" (июнь 1987 г., Москва), IX етней Амперовской школе (сентябрь 1987 г.,

Новосибирск), Всесоюзной конференции "Преобразовани световой энергии в фотосинтезирующих системах и и моделях" (июнь 1989 г., Пущино), VIII Всесоюзно конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине (май 1990 г., Звенигород), Российско-Американско семинаре по фотосинтезу (май 1992 г., Пущино), семинар Голландского общества "Biospec" (февраль 1994 г. Лейден), семинаре Европейского научного фонда (апрел

1995 г., Вай, Англия), Международной конференци
"Биоэнергетика фотосинтеза" (июнь 1996 г., Пущино), XI
Международном биофизическом конгрессе (август 1996 г.
Амстердам), IV Международном симпозиуме "Магнитные
спиновые эффекты в химии и родственные явления" (авгус

1996 г., Новосибирск), а также на иных конференциях
семинарах.

Структура и обгьем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов. Она содержит '<>^ страниц, включая f^ рисунков и $~ таблиц. Список литературы включает $fl й ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.