Транспорт одновалентных катионов у бактерий: транспортные системы и принципы их взаимодействия Трчунян, Армен Амбарцумович

Введение к работе

Актуальность проблемы. В осуществлении связи клетка с окружающей средой огромная роль принадлежит мембранным механизма?.: трансформации энергии и транспорта катионов, изучение взаимодействия которых" друг с другом приобретает первостепенное значение.

В современной физико-химической биологии известно, что две мембранные системы клетки могут взаимодействовать друг с другом через специализированные посредники. Согласно хемиосмоти-

ЧЄСКОЙ гипотезе Митчелла (Mitchell, 1961,1966,1968,1976,1985 '),

"первичная" система - дыхательная, или фотосинтетическая цепь и.Н⁺-АТФазный комплекс р_хр₀ работает как протонный насос, вырабатывает дрд+, а "вторичная"- использует ее в качестве источника энергии для таких процессов, как, например, синтез АТФ и транспорт катионов (В.П.Скулачев, 1972,1974; Э.Рэкер, 1979; С.М.Мартирооов, 1981; Дж.Николо, 1985; Л.Л.Гринюс, 1986; Harold, 1972,1977,1978; Hamilton, 1975; Kabaok, 1976,1977,1986; Weat, 1980; Davidson and Knaff, 1982; Maloney, 1982; Jenck,1983; Konings, 1983; Kagava, 1981;; Konlngs etal., 1981;; Harold and

Kakinuma, 1965 ), медду первичными и вторичными транспортны-ми сиотемами происходят косвенное взаимодействие идДтт+ выступает дальнодействугащим источником конвертируемой энергии для мембраны. Множество экспериментальных данных не оставляет сомнений в правильности хемиосмотической гипотезы и косвенного взаимодействия транспортных систем в мембранах митохондрий и бактерий.

Вместе с тем, за последние года стали накапливаться данные о том, что первичные и вторичные системы мембран митохондрий (И.П. Красинская и др., 1984; В.Н.Маршанский и др., 1984; Л.С.Ягужин-ский, И.П.Красинская, 1987; wasteraoff at ai,, 1981,1984; Кга-

sinskaya et al., 1981;; Novgorodov and Yaguzinsky, 1935;

Yagialnsky et al,, 1986; Westerhoff, 1986 ) И

бактерий (Konings, 1983; Elferink et al,, 1981;; Konings et al., 1981;; ELferink, 1986; Kruiwicn, 1986 ) могут вступать в прягло Є взаимодействие друг с другом без посредничества дДц+, образуя белок-белковые комплексы. Во внутримембранное взаимодействие вступают различные транспортные белки бактерий (И.Я.Калачев и др., 1980,1981: А.Г.Волошн и др., 1983; Г.И.Бурд, С.М.Мартиро-

- 4 -COB, 1985; Peterkovsky and Gasdar, 1978; Bourd and Hartirosov, 1983; Voloshin et al., 1983; Cinl et al., 1981).; peterkovsky and Libei-man, 198$ ), образуя домены для мембранной регуляции транспорта и клеточного метаболизма. Эти данные указывают на необходимость углубления и расширения принципа взаимодействия мембранных систем клетки друг с другом. Взаимодействие и передача энергии между различными системами могут происходить не только косвенно черезД|^и^+» но и, возможно, прямо при непосредственном контакте.

Транспортные системы мембраны бактерий, ввиду относительной простоты и автономности последних, представляют наибольший интерес. Бактерии накапливают К⁺ против градиента в концентрациях, на несколько порядков превышавдих содержание этих катионов В среде ( Schultz and Solomon, 1961; Solomon, 1961; Zarlengo and Schultz, 1966; Damadian, 1968, 1973; Nakajima et al., 1979J Backer and Harold, 1980; Bakker and Hangerich, 1981; Erecinska at al,, 198l; Maury and Kepes, 198l; Shonheit et al., 1981j. ).

K⁺ играет важную і-ояь в жизнедеятельности бактерий, в частности, в росте ( MacLeod and Snell, 19lj7} Schultz and Solomon,196l; Harold et al., 1967; Asghar et al., 1973; Ereeinska et al.,198l;

Monot et al., 1982 ) _t в поддержании тургорного давления (С.С.Дургарьян, С.М.Мартиросов, 1980; С.М.Мартиросов, 1981; Orskov, 191^8; Epstein and Schultz, 1965, 1968; Rhoads and Epste-in,1978; Meury and Kepes,1981} Heury et al.,1985}Epstein,1986 ), в стабилизацииДр^+ (В.П.Скулачев, 1978; И.И.Броун и др., 1979; И.И.Броун, Ю.В.Ким, 1982; А.Л.Драчев и др., 1984; skula-. chev, 1978; Arshavsky et al.,198l; Galperin et al., 1982 ), в регуляции транспортных и метаболических процесоов (С.М.Мартиросов и др., 1980,1982; Е.О.Пучков и др., 1982; А.П.Алимов и ДР., 1984; Ennis and Libin, 1961} Lubin and Ennis, 1964; Zarlengo and Schultz, 1966; Willis and Ennia, 1968; Ennis and Artman, 1970; Suetler, 1970; Ennis, 1971} Damadian, 1973} Kay and Gay, 1981} Martirosov et al., 1981} Martirosov and Trohounian, 1981; Tukahashi and Ogure, 198l; Abbe and Yamado, 1982} Henderson and Potuznik, 1982} Tokuda et al., 1982; Keevil et al., 198.} Ere-cinska and Daut3ch, 1985} Letellier and Boulanger, 1986; «aider-haug et al., 1987 ). Важное значение приобретают данные о роли К⁺ для увеличения продуктивности продуцентов аминокислот (А.Ж.

Хачатрян и др., 1986). В настоящее время у бактерий идентифицированы две основные транспортные системы, осуществляющие про-тивоградиентное поглощение К⁺ (В.Н.ГершаноЕич, I980;Rhoada at al.,1976}* Epstein and Laimins, 1980; Helmer et al., 1982; Koba-yashi, 1982; Heefner, 1982; Silver, 1983; Harold and Kakinuma, 1985;^;Rosen, 1986; walderhaug at al., 1987; Bakker, 1988 ). В изучении одной из них - Kd у E.coii достигнут успех,- обнаружена К⁺-зависимая АТФаза (Epstein et al., 1978, 1981j.j Laimins et al., 1978, 1981; Hesse et al., I981j. ). Предполагается, что другая система - тгк у e.coii представляет собой К⁺-ионо-фор и использует в качестве источника энергииД/^-^+ и регулируется С ПОМОЩЬЮ АТФ (Bakker, 1980, 1981, 1988; Meury and Керез, 1981; Bakker and Mangerich, 1982; Kepes, 1981j.; Stewart et al., 1985 ). Такая же система у s.faecaii3 , по предложенной модели ( Bakker and Harold, 1980; Harold and Kakinuma, 1985 ), осуществляет вторичную транслокацию K⁺ в симпорте с Н⁴". Тем самым, допускается косвенное взаимодействие этой системы транспорта К⁺ с протонными насосами бактерий через ДД-^.

Вместе с тем, у в.соїі (С.С.Дургарья-і, С.М.Мартиросов, 1980; С.М.Мартиросов и др., 1980; Durgaryan and Martirosov, 1978; Mar-tirosov and Trchounian, 1981 ) И s.faecalis (С.М.Мартиросов, Л.С.Петросян, 1980; С.М.Мартиросов и др., 1982; Martirosov and petrosian, 1981 ) обнаружен ДЦКД-чувствительный обмен 2Н⁺ клетки на один К⁺ среды, осуществляемый Н⁺-К⁺-насосом, который включает в себе, по-видимому,р.р и тгк . И связь транспорта этих катионов осуществляется, скорее всего, не через

^A/V-

Ни одна из предложенных моделей не объясняет совокупность данных го транспорту катионов у бактерий; остается неизученным транспорт Н⁺ и К⁺ у широкого ряда бактерий. На примере транспорта Н⁺ через FjF и К⁺ через тгк представляется актуальным изучение принципов взаимодействия транспортных систем клетки и обоснование принципа прямого взаимодействия без посредничества ДЛ-1и+ для'совместного экономного использования конвертируемой энергии.

Цаяью настоящей работы явилось изучение транспорта Н⁺ и К* у анаэробно и аэробно выращенных факультативно анаэробных, анаэробных и аэробных грамотрицательных и грамположительных бакте-

рий її установление принципов взаимодействия транспортных систем мембран бактерий.

Были приняты к разрешению следующие основные задачи:

1) определить распределение К⁺ между клеткой и средой у бакте
рий и выяснить природу сил, создающих и поддерживающих высокое
распределение этих катионов между клеткой и средой, включая

ОСОбеННОСТИ генерации AfUjj+;

1. выявить природу поглощения К⁺ у анаэробно и аэробно выращенных Ejcoil и определить, происходит ли изменение характера транспорта катионов при переходе от анаэробиоза к аэробиозу;

2. изучить регуляцию транспорта катионов в связи с энергетическим обменом бактерий и установить роль периплазматического пространства;

3. определить основные закономерности транспорта катионов у различных видов бактерий;

4. изучить принципы взаимодействия транспортных систем мембран бактерий друг с другом, на примере взаимодействия ^ь^и тгк обосновать принцип прямого взаимодействия мембранных систем с образованием белок-белковых суперкомплекоов для совместного экономного использования конвергируемой энергии и предложить модели надмолекулярной организации транспорта катионов. Научная новизна работы. Б результате исследований о использованием широкого набора бактерий и их мутантов накоплен новый экс-

' париментальный материал по транспорту катионов и трансформации энергии у бактерий и предложен новый принцип прямого взаимодействия транспортных систем мембран для совместного экономного использования конвертируемой энергии.

Впервые установлено, что распределение К⁴" между клеткой и средой у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий выше, чем у аэробно выращенных, и соответствующий калиевый равновесный потенциал существенно превосходит A|Ujj+/f ; при этом анаэробно выращенные и анаэробные бактерии имеют меньший АШ, чем аэробно выращенные и аэробные.

Обнаружено двухфазное поглощение К⁺ у анаэробно выращенных грамотрицательных и однофазное - у аэробно выращенных грамот-рицательных и анаэробных и аэробных грамположительных бактерий. Впервые показано, что быстрое поглощение К⁺ в первую фазу у анаэробно выращенных грамотрицательных и поглощение К* у аэроб-

но выращенных грамотрицательных и анаэробных и аэробных грам-

ПОЛОЖИТеЛЬНЫХ баКТерИЙ ОСущеСТВЛЯеТСЯ ЧервЗ Тгк (ИЛИ Trk -TIO-

добную) систему. Медленное поглощение К*" во вторую фазу осуществляется через "дефектную" тгк_ (или тгк -подобную) систему.

Впервые установлено, что ДЩ-чувствительный обмен 2Н⁺ клетки на' один К⁺ среды в первую фазу поглощения К⁺ имеет место у анаэробно выращенных и анаэробных бактерий и осуществляется механизмом, включающим в себя f^Pq и тгк систему. Для обмена 2Н⁺ на один К⁺ о участием тгк системы должен обязательно функционировать f₁?_o ; генетические дефекты в субъединицах р_хр₀ сказываются на характере обмена Ж⁴" на один К* и при дефекте в с. субъединице р₀ Н⁺-К⁺-обмен исчезает.

Установлена роль периплазматического пространства грамотрицательных бактерий в регуляции транспорта катионов, в частности, обмена 2Н* на один К⁺; указана взаимосвязь обмена 2Н⁺ на один К⁺ с изменением поверхностного заряда бактерий.

Впервые осуществлена реверсия механизма, обменивающего 2Н* на один К*, и показана возможность синтеза АТФ с помощью р^р с использованием градиента концентраций К* со стехиометрией 2Н+: К⁺: АТФ.

Выявлена зависимость ДЦКД-чувствительных секреции Н⁺ и АТФ-азной активности протопластов, изолированных мембран и р_хр₀ от содержания К⁺ в среде, наблюдаемую у анаэробно выращенных бактерий и только при структурной целостности Р_аР₀ и тгк системы.

Впервые установлена связь характера функционирования транспортных систем катионов со способом выращивания бактерий и типом клеточного метаболизма.

На примере р_хр_о и тгк системы обосновывается новый принцип взаимодействия транспортных систем мембраны клетки друг с другом - прямого взаимодействия внутри мембраны с образованием белок-белковых комплексов для совместного экономного использования конвертируемой энергии. Внутримембранное взаимодействие транспортных систем дяя совиеотного использования конвертируемой энергии отражает общую закономерность, характерную для анаэробно выращенных и анаэробных бактерий при низкоэффективных энергетических процессах в клетках, тгк (илитгк -подобная) система у аэробно выращенных и аэробных бактерий работает отдельно я косвенно взаимодействует с другими транспортными сие-

- 8 - _

темами мембраны через посредничество а|^т+. Научно-практическое значение работы. Принцип прямого внутри-мембранного взаимодействия транспортных систем даю совместного использования конвертируемой энергии клетки открывает новые возможности в решении проблемы образования белок-белковых комплексов в мембране и кластеризации мембранных белков, изучении надмолекулярной организации транспортных систем и установлении связи функций мембраны с клеточным метаболизмом.

Результаты о взаимосвязи характера транспорта катионов и действия факторов внешней среды со способом выращивания бактерий и типом клеточного метаболизма, а также об особенностях регуляции транспорта катионов с помощью периплазматического пространства важны для направленной регуляции мембранных функций клетки в биотехнологии, повышения продуктивности продуцентов.

Работа выполнена в рамках важнейших работ по общесоюзным научно-техническим программам (№№ госрегистрации 8I060I45 и 01870074669).

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Ш Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси 1981), Всесоюзной школе по биоэнергетике (Дилижан, 1982), Первом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Ш Республи калекой научной сессии по вопросам биофизики (Ереван, 1982), Международном симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней сроды" (Пущино, 1983), Ш Советско-Швейцах ском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Ташкент, 1983), XI Всесоюзном совещании по транспортным АТФа-зам (Ташкент, 1985), Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино, 1986), П Республиканской научной конференции по физико-химической биолс гаи (Ереван, 1986), IX Международном симпозиуме по биоэлектрохимии и биоэнергетике (Сегед, 1987), Всесоюзной конференции "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов" (Рига, 1987), заседании секции биохимии мембран Московского отделение Всесоюзного биохимического общества (Москва, 1987), Всесоюзної совещании "Энергетические аспекты клеточной физиологии" (Пущино , 1988), ХП Йенском симпозиуме по биофизической химии "Направления биоэлектрохимии биополимеров и мембран" (Веймар,

- 9 -1988), Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма^ (Пущино, 1989), др.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 48 работах, в том числе 30 статьях, из них 14 - в журнале "Биофизика", 2 -

В журнале "БИОЛОГИЧесКИе науки", 7 - В журнале " Bioelectro-chemistry and Bioenergetics",

Объем работы. Работа изложена на 343 страницах машинописного текста и .содержит 35 таблиц и 71 рисунок. Библиография включает 534 наименований литературных источников, из них 71 на русском и 463 на иностранных языках.

Структура работы. Работа состоит из введения, семи глав, выводов и указателя литературы.