Введение к работе
Актуальность темы. Поддержание неравновесного распреде-
ления одновалентных ионов между цитоплазмой и внеклеточной жидкостью является одной из основных функций плазматической мембраны. К настоящему времени установлено, что единственной системой, обеспечивающей неравновесное распределение Na и К в ретикулоцитах и в эритроцитах большинства представителей млекопитающих является Na+,K+-насос, сопряженный с функцией Na+,K+-AT$a3u. Эта система обеспечивает компенсацию входящих потоков Na+ и выходящих потоков К*, реализуемых по механизму пассивной диффузии катионов через липидный бислой мембраны и (или) места белок-липидных контактов.
В мембране эритроцитов млекопитающих содержится также набор ионных переносчиков, осуществляющих транспорт по механизму облегченной диффузии: На+,К+,2С1~- и К+,С1~-котранспорт, Ha+/Na+-и На+/Н+-обмен, анионный переносчик [Bernhardt et al., 1988].
Однако, в отсутствии внешних стимулов, относительная активность этих ион-транспортирующих систем, также как и единственного типа каналов, обнаруженных в эритроцитах (Са -активируемые К+-каналы) невысока и составляет от 0,1 до 10% от общей величины входящих и выходящих потоков ионов. Исключение составляет высоко-активный анионный обменник, на долю которого приходится от 10 до 30% мембранного белка, выполняющего основную функцию в регуляции внутриклеточного рН [Knauf, 1937].
Функциональная роль других, перечисленных выше ион-транспортирующих систем сводится, по-видимому, к регуляции клеточного объема.
Набор ион-транспортирущих систем в эритроцитах отличается
большой видовой специфичностью, что открывает уникальные возможности для изучения механизмов функционирования и регуляции частных ион-транспортирующих систем. Так, например, зрелые эритроциты хищников не содержат Na+,K+-Hacoc, а трансмембранный градиент катионов создается за счет сопряженного функционирования Na+/Ca-обмена [Parker, 1978] и Са-АТФазы [Bernhardt et al., 1988]. Именно на этих объектах получены основные сведения о кинетических параметрах Na /Са -обмена. Эритроциты быка, лошади и низкокалиевые эритроциты овец
не содержат Са -активируемых К+-каналов, что создает еозмох-
?+ ность изучения роли внутриклеточного Са в регуляции активности
На+,К+-АТФазы и ионных переносчиков [Bernhardt et al., 1988].
Следует однако отметить, что в безъядерных эритроцитах, как правило, отсутствуют те или иные компоненты системы передачи сигнала от рецептора на ферменты исполнители, что затрудняет изучение гормональной регуляции активности ион-транспортирующих систем. Напротив, в ядерных эритроцитах птиц, пресмыкающихся и рыб содержатся б-рецепторы, сопряженные с аденилатциклазой. На эритроцитах птиц установлено, что 0-адренергическая стимуляция приводит к активации На+,К+,2С1~-котранспорта [Мс Manus, Schmidt, 1978]. функциональное значение этого явления, не установлено. Обнаружили , что в эритроцитах радужной форели (Salmo gairdneri') fi-адренергические катехоламины вызывают интенсивное накопление Na+, обусловленное активацией Na /Н -обмена [Nikinmaa,1982; Cossins, Richardson, 1985].
Исходя из приведенных выше данных исследовали вклад частных ион-транспортирующих систем в регуляцию потоков Na и К+ в эритроцитах карпа (Cyprinus carpiо) в покое и при действии
агонистов адрено- и холино-рецепторов. Учитывая данные о влиянии активности ионных переносчиков на объем эритроцитов и данные об объем-зависимой регуляции транспорта ионов, также изучили влияние осмолярности среды на трансмембранные потоки одновалентных катионов.
Цель и задачи исследования.
1. Оценить влияние ингибиторов частных ион-транспортирую-
щих систем (уабаина, фуросемида и амилорида) на величину
входящих потоков Na+ и радиоактивного аналога К+ - ^b+, а
, RA +
также выходящего потока К ( Rb ) в эритроцитах карпа.
2. Изучить влияние адренергических и холинергических
агонистов, а также активатора аденалатциклазы (форсколина) и
активаторов протеинкиназ А и С (дибутирил ц-АМФ и -форболового
эфира (ТРА)) на активность частных ион-транспортиругощих систем.
-
С помощью холерного и коклюшного токсинов оценить вовлечение ГТФ-связыващих белков в регуляцию ионных потоков Na+ и Kt
-
Исследовать влияние осмолярности среды на объем эритроцитов карпа и величину трансмембранных потоков Na+ и К+.
-
Оценить участие анионного переносчика и Са -активируемых К -каналов в формировании электрического потенциала мембраны эритроцитов карпа.
Научная новизна работы. Установлено, что в эритроцитах
карпа добавление катехоламшов приводит к активации
Na /Н -обмена, однако уровень активации существенно ниже, чем в
эритроцитах форели, что можно связать с различной двигательной
активностью этих рыб. Действие катехоламинов, устраняется
антагонистами |3- но не а-рецепторами и иммитируетг і
форсколином и дибутирил-ц-АМФ.
Впервые показано, что в отличии от большинства других типов клеток, в эритроцитах рыб относительное участие системы протеинкинаэы С в регуляции Ма+/Н+-обмена существенно меньше, нежели протеинкинаэы А. Влияние холинорецепторов на. транспорт одновалентных ионов в эритроцитах карпа не обнаружено.
Впервые установлено, что активация Na+,K+-Hacoca при действии /З-адренергических катехоламинов не устраняется полностью добавлением ингибиторов На+/Н+-обмена или переводом клеток в безнатриевую среду. Это наблюдение указывает на возможность сопряжения /3-рецепторов и На+,К+-АТФазы.
Показано, что 2-х кратное увеличение объема эритроцитов карпа приводит к 3-5 кратному увеличению входящих и выходящих потоков "'Rb'1', что судя по частичному ингибирующему действию фуросемида связано с активацией ^.(Л'-котранспорта.
Сжатие клеток сопровождается увеличением скорости На+/Н+-обмена более чем на два порядка. Влияние клеточного объема на На+,К+-насос, На+,К+,2СГ-котранспорт не обнаружено. Предполагается, что К^СГ-котранспорт и Na+/H+-o6MeH являются основными ион-транспортирупцими системами, обеспечивающими регуляцию объема эритроцитов карпа.
Установлено, что в присутствии протонофора увеличение
2+
внешней концентрации Са не приводит к гиперполяризации
мембраны эритроцитов карпа. В отсутствии протонофора валиномицин не- влияет на электрический потенциал мембраны эритроцитов карпа. На основании этих данных можно заключить, что в эритроцитах карпа отсутствуют Сас -активируемые К -каналы, а эффективность работы анионного переносчика в электрогенном режиме крайне низка.
Научно-практическая значимость работы. На основании данных о регуляции активности На+/Н+-обмена и Na ,К+-насоса fj-адренергическими катехоламинами, а также данных о низкой активности работы анионного переносчика в электрогенном режиме предложена схема регуляции внутриклеточного рН в эритроцитах рыб /J-адренергическими катехоламинами. По-видимому, обнаруженный механизм реализуется в условиях повышенной двигательной активности и обеспечивает высокое сродство гемоглобина к О? в условиях закислення плазмы крови, вызванного интенсификацией процессов гликолиза и липолиэа.
Результаты работы представляются также важными для интерпретации данных по нарушениям гормон- и объем-зависимой регуляции ион-транспортирувдих систем в эритроцитах.
Основные положения работы используются в курсе лекций и
практических занятий, проводимых на кафедрах биофизики и
физиологии человека и животных МГУ, а также кафедре биофизики
Томского медицинского института.
Апробация работы. Результаты работы докладывались: на Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизм его регуляции'' (Тбилиси, 1989); Всесоюзной конференции патофизиологов (Кишенев, 1989); заседании Московского общества испытателей природы (Москва, 1990); Всесоюзном семинаре "Вопросы метаболизма рыб" (Планерское, 1990); П-ом Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рыб" (Ростов-Великий, 1990); семинаре Института физиологии Мюнхенского университета (ФРГ, 1991).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (165 ссылок). Работа изложена на 136 страницах, содержит 13 рисунков и