Введение к работе
Актуальность проблемы. Организация уникальной пространственной структуры белка представляет собой одну из наиболее важных проблем молекулярной биофизики. Эта проблема не только структурная, но и термодинамическая, поскольку белок является макроскопической системой. Разрешить эту проблему нельзя без термодинамического исследования процесса структурной организации этой системы или обратного ему процесса распада структуры белка под воздействием различных факторов. Среди воздействий, которые могут привести к распаду нативнои структуры белка, к его денатурации, особое место занимает температурное воздействие. Это связано с тем, что температура является интенсивным термодинамическим параметром, сопряженным с энтальпией - термодинамическим потенциалом, описывающим энергетическое состояние системы. Получить прямую информацию о тепловой денатурации белка можно лишь исследуя калориметрически распад его нативнои структуры под воздействием возрастающих по интенсивности тепловых колебаний.
Стабильность белка определяет его динамику и свойства как молекулярной машины. В то время как пространственная структура белка может быть определена очень точно, вклады конкретных физических механизмов в температурную стабильность белка еще мало понятны. Многочисленные попытки установить закономерности стабилизации глобул анализом уже собранной структуры нативного белка не привели к желаемой ясности. Все это определяет актуальность изучения закономерностей стабилизации структуры белка.
Существенным свойством денатурации белков является ее способность отражать процессы, происходящие в кооперативном ансамбле глобулы, т.е. давать информацию о сумме всех взаимодействий в системе. В настоящее время вклады отдельных аминокислот в температурную стабильность белка изучаются с помощью сайт-специфического мутагенеза. Применение методов генетической инженерии для введения точечных и блочных мутаций в белковой молекуле позволяет выяснить природу взаимодействий, определяющих стабильность пространственной структуры белка, и установить взаимосвязь между структурой и функцией.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение закономерностей стабилизации белков разной структурной организации путем изучения влияния блочных мутаций на кокфорг.:аци:о н параметры тепловой денатурации однодоменных бактериальных рибонуклеаз и калмодулина, состоящего из двух глобулярных долей. В задачу работы входило: (а) изучение отличий в конформации, стабильности и каталитических свойствах барназы, биназы и гибридов, составленных из различных участков аминокислотной последовательности этих рибонуклеаз, а также отличий в энергетике комплексов рибонуклеаз с внутриклеточным белковым ингибитором барстаром; (б) исследование конформационного состояния и плавления калмодулина и его мутантов с измененным электростатическим потенциалом, в которых кластеры кислотных остатков заменены на кластеры основных остатков.
Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что тепловая денатурация рекомбинантных биназы, барназы и их гибридов в широком диапазоне рН является переходом между двумя состояниями. Установлены участки биназы и барназы, определяющие тип термостабильности гибрида по отношению к исходным рибонуклеазам. Впервые обнаружено, что изменения свободной энергии денатурации вследствие множественных мутаций в барназе, определенные по данным тепловой денатурации и по денатурации мочевиной, совпадают, а влияние блочных замен на стабильность барназы аддитивно. На примере комплекса биназы с барстаром определены кооперативные свойства и механизм плавления белок-белковых комплексов. Впервые продемонстрирована важная роль электростатических взаимодействий в стабильности и гибкости калмодулина, а также во взаимном влиянии его долей друг на друга. Установлена обратная зависимость между сродством к кальцию и термостабильностью, обнаружено специфическое влияние ионов какодилата на содержание а-спиралей в калмодулине. Термодинамический подход к изучению белков разной структурной организации позволил продемонстрировать роль блочных мутаций в определении закономерностей их стабилизации. Полученные результаты могут быть использованы для инженерии бактериальных рибонуклеаз, являющихся эффективными агентами против вирусов животных и растений, с целью приобретения ими желаемых новых свойств. Знание закономерностей изменения термостабильности белков важно для задач практической биотехнологии. Определение конформационной стабильности калмодулина, ключевого белка в регуляции потока информации в эукариотической клетке, важно для понимания механизма преобразования количественного сигнала кальция в качественный клеточный ответ.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 9-й Конференции по биомолекулярной стереодинамике (Олбани, США, 1995); 4-ом Европейском симпозиуме по кальций-связывающим белкам в нормальных и трансформированных клетках (Перуджа, Италия, 1996); Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А. Баева (Москва, Россия, 1996); 4-ом Международном симпозиуме "Рибонуклеазы: химия, биология, биотехнология" (Гронинген, Нидерланды, 1996); 1-й Международной конференции по применению биокалориметрии (Оксфорд, Англия, 1996); 10-й Конференции по биомолекулярной стереодинамике (Олбани, США, 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на/її? страницах и включает в себя ^таблиц и