Введение к работе
Актуальность проблеми. В последнее время установлено, что активация различными нитро- и нитрозосоединенияии одного из ключевых регуляторних внутриклеточных ферментов гуанилатциглазы .обусловлена общим метаболитом - оксидом азота (N0) .который эти соединения могут продуцировать в беоклеточкых препаратах /Игнар-ро с соавт.,1981,Мурад с аоавт;Д978/.
Ранее считалось, что оксид азота возникает в тканях только из экзогенных соединений /Ванин,1984/. Однако, не так давно было показано, что Ш продуцируется в ходе некоторых метаболических процессов кз ендогенних предшественников. Одним аз них может быть аминокислота аргинин, окисление аминогруппы которой с последующим отрывом и может приводить к сбразованяю в организме оксида азота /Гиббс,19В6',Монкада с ссавт.,1937/.
Оксид азота в тканях но мо:.*ст существовать длительное время з свободном виде лрезде всего из-за атаки на него различных реагентов - в первую очередь активных форм кислорода.. Поэтому ватное значение имеют агенты, способные эффективно стабилизировать и связывать КО,.предотвращая его тем самим от всевозможных превращений.
Известно, что железо и оксид азота образуют в тканях вместе с тиоловыми группами белков данатрозильние комплекси, характеризующиеся сигналом ЭПР с gCD~2,03. Впервые такие комплекси, названные в соответствии со средним значением g-фактора сигнала ЭПР, которым они характеризуются, комплексами 2,03, были обнаружены и изучены в тканях животных Заниякм А.Ф. и сотрудниками его группы.
Б этой связи возникает необходимость детального изучения комплексов 2,03 в биообъектах. Мы начали такие исследования в 1978-79 гг. До появления нашей работа не было известно могут ли железо п оксид азота в ткалях,образовывать комплексы с другима анионными лигаядами, природа которых отличается .от тиоловых. О возможности возникновения таких' комплексов могли свидетельство -вать, например, результаты работ Рича с соавт./1970/, обнаруживших в биообъектах высокоспяновые (ВС) нитрозильине комплексы железа. Ясио, что если железо 2 оксид азота могли бы наряду с комплексами 2,03 включаться я в комплексы о другими анионными лиганда-ми, то причлось бы по-новому пересмотреть предложенные к настоящему времени механизмы образования комплексов 2,03 и количественные спанкн компонентов этах комплексов - яалеза и оксида азота в
тканях. Таким образом исследование комплексов 2,03 может дать сведения о взаимоотаслении и некоторых сторонах метаболизма компонентов этих комплексов железа и оксида азота в тканях. Исходя из вышеизложенного, целью,работы явилось:
изучение взаимоотношения хелеза и оксида азота в различных био--логических системах - тканях животных.лястьях высших растений и бактериях;
выявление возможности образования в биообъектах комплексов железа и оксида азота с различными анионными лигавдаш, отличными от тиоловых;
исследование возможности продукции НО из экзогенных источников оксида аэота - нитропруесида и нитроглицерина, в водных растворах и тканях животных.
Достижение указанной цели составило, основу развиваемого в работе научного направления, связанного ,с исследованием проблемы стабилизации железом универсального регулятора внутриклеточного метаболизма - оксида азота в биологических системах.
Основные положения, выносимые на зашиту;
і.Свободное железо связывает оксид азота только посредством включения в комплексы 2,03 с тиоловшли группами белков. В биообъектах отсутствуют эндогенные лиганды , отличныэ от тиоловых .способные образовывать комплексы с железом и оксидом азота.
2.Тиолсодеркащие соединения и ионы железа влияют на раопад нитропруесида и нитроглицерина, в результате этого усиливается выход по из растворов этих соединений.
З.В листьях высших растений и бактериях имеется свободное яе-лезо, детектируемое с помощью метода &ПР по включению в ди- или иононитрозилъные комплексы о различными лигандамя.
4.Методика определения количественного содержания оксида азота, образующегося в табачном дыме.
Н\учная новизна. Предложена концепция о стабилизирующей роли иегемового железа в функционировании оксида азота в клетках и тканях.
Зперпце установлено, что комплексы 2,03, являющиеся единствен-яш.'и,' которые образуют келезо и оксид аэота представляют собой оптимальную -Тзорму хранения во в клетках.
Показано, что в листьях высших растений и бактериях имеется свободное железо, количество которого составляет 4-5 мкг/г влажной
ткани и 5-10 мкг/r влажных клеток.
Впервые установлено, что ионы нигропруссида в тканевых препаратах подвергаются восстановительному распаду с образованием групп Fe -NO, которые включаются о тиоловими группами сделкой в комплексы 2,03. Показано, что восстановители и тиолсодержащиа соединения оказывают воздействие на продукция ко из растворов нитропруссида (ЇЇП) и нитроглицерина <НГ). При распаде НП и НГ в присутствии лигаядов свободный оксид азота, оставаясь в растворе, образует комплексы 2,03.
Обнаружено, что внутриклеточная среда влияет на структуру комплексов 2,03, возннкающяхт vivo в печена животных. Таким образом биологически активное соединение оксид азота мокет присутствовать внутри клеток, поддерживаясь на-стационарном уровнз.
Разработана методика для количественного определения но ,образующегося при сгорании табака. Установлено, что в табачном дане, образующемся при сгорании одной сигареты, содержится 10" 'М но.
Практическая ценность работы, Обнаруженная наїли способность раствора ЭДТА извлекать железо из железодепонирующих систем может быть использована для оценки с помощью метода clip негемового ;ке-леза в биологических объектах. Наши данные сввдетельствуэт, что липосоин, нагруженные нигропруссидом можно использовать в качестве метки, позволяющей судить как об интактности их в крови, так я распределении липосом в тканях животных in vivo . Полученные данные о наличии свободного келеза в высших растениях и бактериях имеют ванное значение при изучения метаболизма «елеза в этих биообъектах. Результаты экспериментов по исследованию высвобождения Ш из рзстворов НП н ЯГ могут найти применение при изучении фармакологического действия указанных кардиотерапевтических средств. Данине о пиутраюштсчнсіі локализации комплексов 2,03 могут быть полезны при количественной оценке й исследовании превращений N0 в тканях.
Методика количественного определения оксзда азота в табачном дыне может найти применение при создании сигаретних фильтров, улавливавших физиологически активное соединении - SO .образующийся при сгорании табзка и предотвращающие его попадание в организи курящего.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Всесоюзном симпозиуме "Магнитеый резонанс в биолбгия и медицине"
(Москва, 1981) ; 1-ом советско-индийском симпозиума "Спектроскопия магнитного резонанса неорганических материалов" (Душанбе, 1982); 1 Всесоюзном биофизическом съезде ( Москва, 1982); 17 Международном симпозиуме "Регуляция метаболизма в растениях"(Варка, Болгария, 198S); Конференция молодых ученшс Академик наук Азерб. ССР С Баку, 1987); 11 республиканской конференции ученых-химиков (Баку, 1987) ; У республиканской межвузовской конференции по физике (Баку, 1992); Республиканской научной конференции "Физика-1993" ( Баку.1993) и 11 Международном симпозиуме "Энергия,экология, экономика"( Баку, 1993), а также включены в материалы 1 Международного симпозиума "Минеральное питание и фотосинтез" ( Варна.Болгария, 1987); 3-го Международного конгресса "Гормоны и рак4 (Гам-бург.ФРГ, 1987); 71-го конгресса Федерация европейского общества исследователей рас тений ( Сплит, Югославия, 1988); 6-го симпозиума "Спектроскопия ЭПР э биохимии,молекулярной биологли"-( Прага,Чехословакия, 1983); 9-ой международной конференции "Белки в транспорте 2 накоплении железа" ( Брисбан,Австралия, 1985); 19 заседания Федерации европейских биохимических обществе Рии,Италия, 1989) и Международной конференции по гемохроматознсу и клиническим проблемам метаболизма железа ( Тель-Авив .Израиль, 1993).
Публикации, Оановнве результаты диссертационной работы отражены в 44 научных трудах, в том число а 18 статьях, опубликованных в республиканских и зарубежных изданиях.
Объем.и отогкттра таботнт Диссертационная работа изложена на 215 страницах машинописного текста, включает 4 таблицы н 67 рисунков* состоит из введения,, шести глав,выводов и списка цитируемой література, состоящего из 215 изпконовокяй.