Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Возрастающая с каждым годом активность з изучении процессов функционирования клетки и целого организма, приводит к широким перспективам в борьбе с ранее неизлечимыми эолезнями, в том числе раком, СПИДом, болезнью Альцгеймера и др. Данный прорыв в области медицины стал возможен благодаря широкомасштабным фундаментальным исследованиям механизмов действия цитокинов, которые участвуют в регуляции иммунных процессов в организме. Данная область лежит на стыке химии, физики и биологии, благодаря чему обеспечивается разносторонний подход к данной проблеме. Роль липидной компоненты клетки была и остается одним из интригующих вопросов в процессе передачи клеточного сигнала, 'чем объясняется большое количество работ в мире, посвященных этой теме.
Фактор некроза опухоли-а (ФНО-а) - полипептид с молекулярной массой 17 кДа, принадлежащий к семейству цитокинов, продуцируется, в основном, активированными моноцитами и макрофагами (Carswell et al., 1975; Old, 1985; Fiers, 1991; Beutler & Cerami, 1988; Aggarwal & Natarajan, 1996). Первоначально интерес к изучению свойств ФНО был вызван его способностью вызывать геморрагический некроз некоторых видов опухолей in vivo, а также токсическим действием на опухолевые клетки in vitro (Carswel! et al., 1975). В настоящее время показано, что ФНО-а участвует в проведении иммунного клеточного ответа, влияет на рост и дифференцировку клеток и обладает множеством других биологических функций (Fausher et al., 1988; Gehr et ai., 1992; Kirsheis et a!., 1992; Ohta et al., 1995,1996). Биохимический механизм передачи сигналов, реализующих разнообразные эффекты ФНО-а, а том числе, его цитотоксическое действие,
в настоящее время недостаточно изучен. В частности, известно, что начал» передачи сигнала от ФНО-а определяется его взаимодействием с двум: клеточными рецепторами с молекулярными массами 55-60 кДа (R55) и 75-81 кДа (R75) (Fiers, 1991;Vandenabeele et al., 1995;Loetsher et al., 1993;Tartagli et al., 1992). В то время как сведения о передаче сигнала с помощью R7: рецептора довольно ограниченны, в отношении рецептора R55 показане что именно взаимодействием с этим рецептором определяете цитотоксичность фактора некроза опухолей (Yanaga & Watson, 1992 Beyaert & Fiers, 1994). Многочисленными экспериментами установлено, чт> рецептор R55, помимо цитотоксичности, определяет и" другие свойств ФНО-а, такие как индукция биосинтеза цитокинов, пролифераци фибробластов, синтез простагландинов и др. (Aggarwal & Natarajan, 1996] Кроме того, взаимодействие ФНО-а с рецептором R55 приводит активации сфингомиелиназы в клетках NIH ЗТЗ и накоплению церамидг который, как полагают, могут участвовать в индукции апоптоза, вызванное фактором некроза опухолей (Kim et al.,1991; Obeid et al., 1993). Однако функциональной роли сфингозина в проведении цитотоксического сигнал ФНО сведений в литературе крайне недостаточно. Тем не менее это метаболит сфингомиелинового цикла привлекает внимание в связи высокой его токсичностью и множеством функций в передаче клеточны сигналов (регуляция активности протеинкиназ и протеаз, мобилизаци кальция и др.) (Hannun & Bell, 1989; Sohal & Cornell, 1990; Zhang et al., 1990 Использование ФНО-а в качестве противоопухолевого агента осложняете его высокой общей токсичностью для организма опухоленосителя, которав по-видимому, коррелирует с токсичностью для клеток. Поэтому выяснени сигнального механизма, ответственного за цитотоксичность ФНО-с позволит направленно формировать стратегию терапевтическог примененияФНО-а.
ЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось іределение функциональной роли продуктов сфингомиелинового цикла в :редаче цитотоксического сигнала мутантных форм фактора некроза гухоли человека в клетках печени мышей.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
Исследовать роль точечных и делеционных мутаций в структуре молекулы :комбинантного фактора некроза опухоли-альфа в его цитотоксичности и юсобности к активации сфингомиелинового цикла и накоплению зингозина.
Изучить действие сфингозина как цитотоксического, мутагенного и ггимутагенного агента.
Исследовать сходство между действием сфингозина и фактора некроза г/холи как агентов, вызывающих крупноблочную-фрагментацию ДНК в іетках печени мышей in vivo.
і Используя видоспецифичность рецепторов ФНО, изучить путь активации :на с-тус фактором некроза опухоли через 1155-рецептор ФНО, взывающий активацию сфингомиелинового цикла.
АУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенных экспериментов знаружена корреляция между цитотоксичностью мутантных форм жомбинантного фактора некроза опухоли-альфа и накоплением продукта гградации сфингомиелина - сфингозина - в клетках печени мышей in vivo, оказано отсутствие подобной корреляции с уровнем других составляющих |)ингомиелинового цикла - сфингомиелина, церамида, активностью ермента сфингомиелиназы.
Показана роль точечных и делеционных мутаций в структуре олекулы рекомбинантного фактора некроза опухоли-альфа в его
цитотоксичности и способности к активации сфингомиелинового цикла і накоплению сфингозина.
Изучено действие сфингозина как мутагенного и антимутагенноп агента и показана его способность к избирательному антимутагенном] действию.
Установлена корреляция между действием сфингозина и факторі некроза опухоли как агентов, вызывающих крупноблочную фрагментации ДНК в клетках печени мышей in vivo.
Используя видоспецифичность рецепторов ФНО, был изучен пут: активации гена с-тус фактором некроза опухоли. Была показана связ между действием фактора некроза опухоли-альфа, активирующей сфингомиелиновый цикл через 1155-рецептор ФНО, и активацией ген раннего ответа с-тус, что позволяет сделать заключение об участиі продуктов сфингомиелинового цикла в активации гена с-тус.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаті проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическо значение для понимания механизмов действия мутантных форі рекомбинантного фактора некроза опухоли-альфа и роли продукте сфингомиелинового цикла в передаче индуцированного им сигналі Полученные данные могут быть использованы в медицине и фармакологи для разработки стратегии терапевтического применения ФНО-с Полученные при этом результаты могут быть, с одной сторонь использованы для комбинированного лечения злокачественны новообразований, а, с другой стороны, учтены при направленном синтез новых мутантных форм ФНО-а, обладающих цитотоксическим действие природного цитокина, но проявляющих более селективное действие.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены на I Международном Симпозиуме по биохимии липидов, Сапкт-стербург, 1994 г., на Всероссийской школе-конференции молодых існьїх «Современные проблемы молекулярной биологии», ерноголовка, 1995 г., на конкурсе работ молодых ученых ИХФ РАН, на > Международной конференции по биохимии липидов, 1994, Абердин Цотландия), на 6 Североамериканском симпозиуме по изучению ;енобиотиков, 1994, Ролли (США), на 4 Международном Съезде [еждународіюго Общества по изучению ксенобиотиков, 1995, Сиэтл ЛЛА), на 6 Международном Конгрессе по изучению ФИО, 1996, Родос реция).
УБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных ібот.
ТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из (едения, обзора литературы, описания материалов и методов следования, изложения результатов исследования и их обсуждения, .гводо'в и списка цитированной литературы.
Текст диссертации изложен на страницах машинописного
:кста, иллюстрирован таблицами и рисунками. Библиография
:лючает наименований.
1) Мутантные формы рекомбинантного фактора некроза опухоли-
іьфа вызывают накопление сфингозина в клетках печени мышей и эти
іменсния коррелируют с цитотоксичностью мутантных форм ФНО.
2) Сфингозин обладает избирательной антимутагенной
стивностью, предотвращая мутации типа сдвига рамки считывания.
-
Мутантные формы рекомбинантного фактора, некроза опухоли-альфа и сфингозин вызывают аналогичные картины крупноблочной фрагментации ДНК в клетках печени мышей in vivo.
-
Активация генов раннего ответа (на примере онкогена с-тус), продукты которых участвуют в проведении сигнала апоптоза, индуцируется через И55-рецептор ФНО, связанный с индукцией сфингомиелиновогс цикла.