Введение к работе
Актуальность проблемы. Понимание механизмов активации генома и последующей активизации метаболических процессов является весьма актуальным в изучении жизненно важных процессов, происходящих в клетке. Выявление молекулярных механизмов внутренних регуляторных систем растений при прорастании и стимуляции фитогормонами может пролить свет на особенности механизмов действия тех или иных факторов, влияющих на экспрессию генома. Развитие представлений о внутренних регуляторных системах растений, а также практическое применение фитогормонов и других биологически активных соединений может выявить молекулярные механизмы их действия на генетический аппарат клетки.
Особый интерес представляют исследования по выявлению механизмов стимулирующего действия природных гормонов и гормональных соединений как для непосредственного внедрения в сельскохозяйственную практику, так и для разработки и синтеза новых, более продуктивных стимуляторов. Модельная система,- "прорастающий зародыш" предоставляет возможность для исследования процессов развития, которые не могут дать другие живые системы. Биосинтез белка и его регуляция в прорастающем зародыше семян связан с двумя аспектами: а) рассмотрением на молекулярном уровне процессов, "активирующихся" в начальных стадиях прорастания и б) поиском возможных регуляторных звеньев, вызывающих усиление указанных процессов.
"Прорастающий зародыш" можно рассматривать и как модель типа клеток с определенными "характеристиками", а именно исходным состоянием вынужденного покоя, т.е. со свойствами, которые присущи весьма ограниченному числу клеточных систем, и, позволяющих использовать их в качестве удобной модели для исследования механизмов активации клеточного метаболизма.
Гормоны участвуют в регуляции покоя и прорастания семян, и поскольку в семенах часто взаимодействуют несколько гормонов, выработался особый механизм для подавления или усиления действия одного гормона другим. Молекулярные механизмы действия растительных гормонов остаются недостаточно изученными. Как класс растительных гормонов гиббереллины (ГК) вовлечены в регуляцию или контроль некоторых самых разных морфогенетических физиологических и биохимических ответов. Регулирование разнообразных активностей указывает на то, что ГК действуют на хроматиновом уровне (Stoddart, 1980).
В настоящее время показано, что ядерный матрикс играет немаловажную роль в инициации и репликации ДНК, а также в синтезе, процессинге и транспорте РНК. В составе хроматина и хромосом эукариотических клеток обнаружены липиды и, в частности, фосфолипиды, которые несут определенную функциональную нагрузку. Не исключено, что фосфолипиды, входящие в состав хроматина, принимают активное участие в процессах, затрагивающих ядерные структуры (Геворкян, 1990).
Выявление изменений в хроматине и его компонентах при изменении функционального состояния зародышей пшеницы (прорастание, обработка гормоном) может дать ответ на понимание механизмов действия различных факторов. Изучение происходящих при этом динамических изменений может выявить неизвестные механизмы регуляции и экспрессии растительного генома.
Недостаточная изученность вышеотмеченных проблем делают актуальным исследование хроматина зародышей пшеницы как на структурном, так и на функциональном уровнях при прорастании и обработке гиббереллином.
Цель и задачи диссертации. Целью настоящей работы явилось изучение хроматина зародышей пшеницы при активации, и определение структурных изменений его отдельных компонентов при прорастании и стимуляции гормоном.
Были поставлены следующие задачи:
выделить и охарактеризовать фракции хроматина в сахарозном граденте после высокоскоростного центрифугирования при их гидролизе в мягких условиях ДНК-азой II,
провести анализ профилей дифференциальных кривых плавления высокоактивной фракции хроматина и определить параметры плавления фрагментов ДНК, выделенных из высокоактивной фракции хроматина сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином изолированных зародышей пшеницы,
выявить качественные и количественные изменения в составе фосфолипидов хроматина сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином изолированных зародышей пшеницы и их влияние на структуру ДНК,
определить степень перестроек, затрагивающих отдельные классы фосфолипидов и выявить различия, обусловленные активацией генома (прорастание, обработка фитогормоном).
Научная новизна, научно-практическая значимость работы.
В исследовании хроматина и его отдельных компонентов при прорастании зародышей пшеницы показано значительное перераспределение фракций хроматина в сахарозном градиенте после высокоскоростного центрифугирования. Выявлены существенные изменения во фракции активированного хроматина прорастающих зародышей пшеницы по сравнению с сухими зародышами. Обнаружены изменения в дифференциальных кривых плавления (ДКП) во фракциях хроматина, а также фрагментах ДНК из прорастающих и обработанных гиббереллином зародышей пшеницы по сравнению с сухими.
Детальное исследование фосфолипидов хроматина сухих, прорастающих и обработанных гиббереллином зародышей пшеницы выявило шесть индивидуальных классов фосфолипидов (фосфатидилхолины - ФХ, фосфатидилэтаноламины - ФЭ, фосфатидилинозіггош - ФИ, фосфатидил-серины - ФС, лизофосфатидилхолины - ЛФХ, кардиолипины - КЛ). Выявлены значительные сдвиги фосфолипидного состава хроматина при прорастании и обработке гиббереллином.
Полученные в данной работе результаты указывают на то, что отдельные компоненты хроматина при активации подвергаются значительным перестройкам.
Основные положения работы, выносимые на защиту.
-
Прорастание зародышей пшеницы приводит к перераспределению фракций хроматина в сахарозном градиенте.
-
ДКП фракций хроматина и соответствующих фрагментов ДНК подвергается значительным изменениям при прорастании и обработке гормоном зародышей пшеницы.
-
При прорастании зародышей пшеницы имеют место количественные сдвиги в фосфолипидах хроматина и его активной фракции и эти сдвиги связаны со структурными изменениями хроматина.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции, посвященной 75-летию ЕГУ (Ереван, 1994), на конференции, посвященной 30-летию основания отделения биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета (Ереван, 1996), и в отделе молекулярной биологии корпорации специализированных лабораторий (Санта-Моника, Лос-Анджелес, США, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 3 в зарубежной печати.
Объем и структура работы. Работа изложена на 127 страницах русского машинописного текста и содержит 6 таблиц и 18 рисунков и списка использованной литературы, включающего 225 наименований.
Диссертационная работа состоит из Введения, трех глав (I - Обзор литературы, II - Материалы и методы исследований, III - Результаты и их обсуждение) и Заключения, а также Выводов и Списка литературы.
В обзоре литературы приводятся сведения о современных представлениях о структурной организации растительного хроматина и методических подходах по изучению его структуры.
Краткое содержание остальных глав приведено ниже.