Введение к работе
Исследование процессов протеолитического расщепления белковых молекул в клетках является одной из важных задач современной биохимии.
Последние годы все большее внимание исследователей привлекает протеолитическое разрушение чужеродных, регуляторных и утративших свои биологические функции белков - так называемая протеолитическая деградация.
Этот вид протеолиза широко распространен в живой природе, причем при исследованиях на клетках прокариотов было установлено, что до 90% протеолитической деградации сопряженно с гидролизом АТФ.
Ферменты, осуществляющие АТФ-зависимый протеолиз в прокариотах наиболее хорошо исследованы в Exoli. Одним из представителей класса АТФ-зависимых протеиназ является Lon-протеаза Е.соН. Она является первым ферментом этого класса, который был выделен в чистом виде, охарактеризован энзиматически, и для которого была определена аминокислотная последовательность.
Lon-протеаза является представителем уникального класса протеолити-ческих ферментов, в которых в одной полипептидной цепи присутствуют два различных, но функционально взаимосвязанных активных центра.
Установлено, что Lon-протеаза является сериновой протеиназой и осуществляет гидролиз чужеродных, мутантных и некоторых регуляторных белков. При дальнейших исследованиях оказалось, что Lon-протеаза не только выполняет функции дефадации неактивных белковых молекул, но и влияет на протекание многих других процессов жизнедеятельности клетки.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении свойств и структурных особенностей Lon-протеазы, многие аспекты строения и функ-
ционировакия фермента до сих пор остаются неясными. Из-за высокой лабильности функционально активного комплекса Lon-протеазы и невысокого уровня содержания фермента в клетках практически отсутствуют данные о вторичной и третичной структуре протеазы. Сложности, возникающие при выделении и очистке фермента, а также большие размеры молекулы (784 а.к.) не позволяют исследовать пространственное строение Lon-протеазы методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса. В настоящее время строение активных центров Lon-протеазы и локализация аминокислотных остатков, принимающих участие в катализе точно не установлены. Существует также ряд теоретических положений о структурно-функциональных особенностях Lon-протеазы, не подтвержденных экспериментально. В последнее время появилось значительное количество данных о первичных структурах родственных Lon-протеазе ферментов, выделенных из разных источников. Однако публикации имеют ориентацию на определение первичных структур, а не на анализ данных. Поэтому подробный сравнительный анализ всех известных аминокислотных последовательностей АТФ-зависимых Lon-протеаз до сих пор не осуществлялся.
Из вышеизложенного следует, что систематический компьютерный анализ аминокислотных последовательностей, исследование структурно-функциональных особенностей Lon-протеазы, расчет элементов ее
пространственной структуры и—экспериментальная—проверка—гипотез—а
строении и локализации активных центров фермента являются актуальной проблемой для изучения как молекулярных механизмов, так и молекулярной эволюции ферментов протеолиза.
Данную работу проводили в рамках осуществляемых в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН комплексных исследований АТФ-зависимых протеолитических ферментов.
Целью работы является:
-
Проведение систематического сравнительного анализа первичных структур Lon-протеаз, полученных из различных источников и построение филогенетического дерева семейства Lon-протеаз.
-
Построение модели вторичной структуры Lon-протеаз и определение границ функциональных доменов.
-
Получение с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза мутантных форм Lon-протеазы E.coli с аминокислотными заменами в предполагаемых активных центрах функциональных доменов.
-
Сравнительное изучение ферментативной активности мутантных форм Lon-протеазы E.coli.
-
Исследование взаимного влияния функциональных доменов на ферментативные активности Lon-протеазы.
-
Построение модели механизма действия фермента.
В данной работе был проведен подробный структурно-функциональный анализ полученных из различных источников аминокислотных последовательностей Lon-протеаз - ферментов, играющих важігую роль в процессах вігутриклеточной деградации белков и пептидов.
На основании проведенного анализа получено филогенетическое дерево белков семейства Lon-протеаз, позволяющее судить о процессе эволюции АТФ-зависимых протеолитических ферментов. По результатам анализа предложено выделить три эволюционно и функционально различных группы АТФ-зависимых Lon-протеаз.
Построена модель вторичной структуры Lon-протеазы с достоверностью 70-80%.
Определены границы функциональных доменов фермента, ранее постулированных на качественном уровне. Это позволяет приступить к работам
по конструированию химерных белков, содержащих отдельные домены Lon-протеазы, что позволит изучить значение энергозависимости фермента.
Экспериментально проверена гипотеза о строении активных центров фермента, получены достоверные данные о локализации каталитически важных аминокислотных остатков.
Полученные результаты позволяют лучше понять молекулярную организацию и механизм действия столь сложного фермента как Lon-протеаза. Данные об активных центрах и элементах пространственной структуры белка открывают возможности дальнейшего изучения механизма действия Lon-протеазы, механизма распознавания ферментом денатурированных белковых молекул, и механизма энергозависимости протеолиза.
Основные результаты диссертационной работы были представлены в докладах на II Российско-Израильском симпозиуме по пептидам и белкам (Москва 1992), на III симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993) и на I Всероссийская отчетно-плановая конференция по направлению "Генная Инженерия" (Москва, 1994). По результатам проведенных исследований опубликовано 6 печатных работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ