Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Термические перестройки плазматических мембран
I. Постановка задачи 17
2. Перестройки в эритроцитарных мембранах 22
3. Плазматические мембраны жировых клеток 33
4. Синаптические мембраны мозга... 40
5. Заключение... 45
ГЛАВА II. Структурные переходы в мембранах с неспецифической или ограниченно специфической инициацией. Действие анестетиков . 55
I. Состояние проблемы и постановка задачи 55
2. Взаимодействие анестетиков с изолированными мембранами эритроцитов. 69
3. Полиэкстремальное влияние местных анестетиков на синаптические мембраны мозга 73
4. О влиянии анестетиков на конформапию белков в мембране. 91
А. Тени эритроцитов. 91
Б. Синаптические мембраны... 95
5. Роль липидного бислоя в блокаде анестетиками систем захвата нейромедиаторов и натриевых каналов синаптосом... 114
А. Действие анестетиков на активный транспорт норадреналина и холина в синаптосомах 115
Б. Действие анестетиков на натриевые и кальциевые каналы синаптосом. Тестирование по
выделению медиаторов 126
В. Действие дикаина на натриевые и калиевые каналы синаптосом, тестируемые по входу
22М и 45Са 138
Г. Сопоставление структурных и функциональных эффектов анестетиков. Участвует ли липидный бислой в блокаде синаптического проведения 144
6. Заключение... 155
ГЛАВА III. Рецепторно-индуцированные перестройки мембран .
1. Анализ литературы и постановка задачи... 159
2. Генерализованные структурные перестройки в системе рецепторы биогенных аминов - Va,K- АТФаза нейрональных мембран... 169
2.1. Феноменология 169
2.2. Двухфазная стимуляция УУ&,К-АТФазы нор-адреналином 171
2.3. Возможные первичные механизмы стимуляции 180
2.4. Механизм сопряжения между рецептором и Л ,К-АТФазой 215
2.5. Функциональные последствия перестройки в системе "рецептор - Т/а.К-АТФаза"... 241
3. Индуцированные инсулином структурные перестройки в плазматических мембранах печеночных и жировых клеток . 246
4. Заключение.. 281
ГЛАВА. ІV. Возрастные изменения структурно-функционального состояния синаптических мембран мозга ... 288
1. Анализ литературы и постановка задачи. 288
2. Возрастные изменения аллостерических свойств ацетилхолинэстеразы мозга 295
3. Структурные особенности изолированных синаптических мембран мозга у животных разного возраста .... 303
4. О влиянии возрастной реорганизации синаптических мембран на структурно-функциональное состояние некоторых мембраносвязанных белков 324
4.1. АТФаза: каталитические свойства и характеристика уабаиновых рецепторов. 324
4.2. р-адренергические и м-холинергичес-кие рецепторы синаптических мембран: па
раметры связывания и реактивность функциональных SH-rpynn. 332
5. Заключение... 349
Основные выводы 353
Приложение. Объекты и методы исследования 357
Литература. 380
- Плазматические мембраны жировых клеток
- Полиэкстремальное влияние местных анестетиков на синаптические мембраны мозга
- Индуцированные инсулином структурные перестройки в плазматических мембранах печеночных и жировых клеток
- Структурные особенности изолированных синаптических мембран мозга у животных разного возраста
Введение к работе
В последние годы биохимия и биофизика достигли решающих успехов в понимании способов функционирования биополимеров в связи с различными уровнями их структурной организации. Для сознательного управления работой клетки необходимы не только знания о строении и функции ее элементарных составных частей, но и ясные представления о взаимодействии этих частей itv v-ivo ,а также, что самое важное - о способах самонастройки и авторегуляции живой машины. В 60-е годы благодаря классическим работам Жакоба и Моно стали известны регуляторные цепи, связывающие цитоплазму и клеточное ядро и управляющие процессом транскрипции, и внутрицитоплазмати-ческие обратные связи, характерные для аллостерических эффектов на уровне отдельных молекул ферментов. Во всех этих случаях первичным регуляторним актом является образование комплементарного комплекса (напр., фермент-продукт, метабо-лит-репрессор, гормон-рецептор и т.д.) за счет слабых неко-валентных связей. В таком комплексе белок претерпевает кон-формационный переход между состояниями с разной функциональной активностью. Во многих случаях вследствие макромоле-кулярной природы важнейших биополимеров структурные перестройки в них кооперативны, и это обстоятельство признано исключительно важным для самых различных молекулярно-биоло-гических процессов /40/. Всегда ли,однако, элементарный ре-гуляторный акт затрагивает только одну молекулу или же возможна генерализация функционально активных локальных изменений на боі&пее число молекул? Гипотеза о возможности существования такого генерализованного механизма регуляции в клетке была высказана С.В.Коневым в 1965 году /71, 371/,
Клетка рассматривалась как кооперативная система, элементарными ячейками которой служат не отдельные звенья полипептидных цепей, а сами молекулы белка или белок-липидные комплексы. Модификация критического числа ячеек, т.е. одновременная перестройка определенного числа партнеров ансамбля, облегчает реорганизацию остальных. В результате волна конформационных превращений распространяется на всю полимолекулярную систему уже под действием малых по величине тепловых квантов или иных факторов, которые имелись и до инициации, но не были ранее эффективными. Естественно, что достаточно высокие и потому функционально-значимые степени кооперативности должны проявляться прежде всего у кристаллических или квазикристаллических тел с интенсивными межмолекулярными взаимодействиями. Как это ни удивительно, но даже обычным растворам некоторых белков (напр.,актомиозину) присущи спонтанные кооперативные колебания, синхронизированные по огромному числу молекул /158/. Цитоплазму же клетки трудно уподобить раствору, поскольку большинство белков либо входит в состав универсальных мембранных структур либо прикрепляется к ним и потому должно находиться в поле интенсивных межмолекулярных взаимодействий.
Именно мембраны обладают нужными морфологическими и молекулярно-энергетическими предпосылками, чтобы стать основными носителями кооперативных свойств клетки /73/. Учитывая это обстоятельство, гипотезу целесообразно конкретизировать следующим образом. Постулируется, что мембраны способны к кооперативным структурным переходам между несколькими дискретными конформационными состояниями, различающимися по величине свободной энергии слабых нековалентных взаимо-
действий и разделенными активационным барьером (структурная лабильность). Происходящие в ходе перестроек изменения кон-формации и (или) взаимоориентации белков и лішидов благодаря интенсивным межмолекулярным взаимодействиям охватывают значительно большие участки мембраны, чем те, которые непосредственно модифицируются регуляторным лнгандом при первичном взаимодействии со стерео-специфическим рецептором (генерали-зованность). Вследствие анизотропии по степени кооператив-ности и существования в мембранах участков с низким уровнем упорядоченности вполне вероятны также и не^-кооперативные, градуальные перестройки. Все подобного рода общемембранные события, в ходе которых меняется пространственное расположение и взаимоупаковка большого числа компонентов, разыгрываются на фоне постоянно протекающих динамических процессов внутри общей конструкции: различного рода молекулярных движений типа латеральной или поперечной диффузии, вращений и т.д., придающих динамический характер организации мембран. При кооперативном переходе, когда достигается критический уровень инициирующего воздействия, значения динамических параметров претерпевают резкий скачек, в то время как при некооперативных перестройках они модифицируются плавно. Перечислим ряд критериев, указывающих на кооперативность перестроек: I) сигмоидная форма переходных участков на кривых доза (температура, концентрация вещества и т.д.)-эффект (конформационно-чувствительный параметр). Нецелочисленные величины коэффициента Хилла, рассчитанные из кривых; 2) резкие изломы на дозовых кривых в тех случаях, когда регистрируется структурно-чувствительный параметр, имеющий кинетическую природу (например, релаксация спинового и фяуорес-
8 центного зонда); 3) скачкообразные изменения функциональной активности с нецелочисленными коэффициентами Хилла; 4) колебания величин конформационно-чувствительного параметра в точке полуперехода/73,340/. В зависимости от характера первичного взаимодействия с мембранами различные химические агенты по-разному инициируют переходы: а) связываясь со специализированными рецепторами (гормоны, медиаторы и т.д.) или с регуляторними центрами ферментов; б) относительно неизбирательно соединяясь с мембранными макромолекулами (анестетики, антибиотики и т.д.); в) практически неизбирательно распределяясь в гидрофобной или гидрофильной фазе (некоторые виды анестетиков); г) неспецифически влияя на заряд или осмотический потенциал (ионы, нетранспортирующиеся углеводы). Естественно, что в излагаемой гипотезе физиологическая роль отводится лишь тем перестройкам, которые по своей природе обратимы и потому могут быть названы функциональными. Таким образом, обсуждаемый механизм регуляции отличается от ранее предложенных схем по крайней мере по трем признакам: I) экспрессному характеру действия; 2) высокой степени генерализации элементарного регуляторного акта; 3) по физическому, а не химическому способу усиления сигнала инициации.
Позже близкие взгляды высказывались и другими исследователями /55, 215, 229, 519/. Шанже /215/ предложил модель мембраны в виде двумерной кристаллической решетки, состоящей из глобулярных липопротеидных протомеров. Протомер способен претерпевать переход благодаря смещению равновесия между двумя предсуществующими популяциями конформеров.Перестройка осуществляется коллективно вследствие интенсивных межпротомерных
. 9
взаимодействий. Представления о жидкомозаичной организации мембран, исключавшие дальнодействия, плохо согласовывались с гипотезой о структурной лабильности. Однако очень скоро стало ясно, что подвижность макромолекул в липидном бислое жестко контролируется белковым цитоскелетом /82, 549/, и твердоэластический липопротеидный каркас стал рассматриваться как главный кандидат на роль канала для передачи конформа-ционного сигнала /73, 76, 82/. На базе твердокаркасной жидкомозаичной модели возникли новые физические идеи о распространении структурного возмущения по белковой решетке /74/ или липопротеидным цепям /519/, о неравновесных состояниях каркаса в виде напряжений /229, 230/, о дальнодействиях по солитонному механизму /55/, В настоящее время существует обширнейшая литература, посвященная структурным преобразованиям мембран (см. обзоры 76, 154), но в I97I-I972 г,г., когда мы начинали свои исследования по проблеме структурной лабильности, появлялись лишь первые сообщения о кооперативных перестройках, наиболее просто выявляемых при градуальном смещении температуры среды на модельных мембранах из чистых фосфолипидов /385/ и бактериальных мембранах /556/, полностью лишенных холестерина. При анализе кооперативных свойств мембран животного происхождения возникли значительные затруднения из-за высокого содержания холестерина, который уменьшает размер кооперативной единицы, предотвращает фазовое разделение и снижает теплопоглощение в опытах на моделях /384/. Поэтому высказывались сомнения в способности плазматических мембран животных клеток претерпевать генерализованные кооперативные переходы.
С позиций гипотезы о структурной лабильности мембран
10 представлял значительный интерес вопрос о механизме действия местных анестетиков. Согласно унитарной теории анестезии /540, 585/, сформировавшейся на основании исследования ли-пидных моделей, потеря возбудимости в периферических нервных волокнах (блокада натриевого канала) достигается благодаря изменению физических свойств липидного бислоя, в котором неспецифически распределяется гидрофобная молекула поверхностно-активного вещества. Однако к 1973-1974 г.г. у элект-рофйзиологов сложилась совершенно противоположная точка зрения - о существовании белковых рецепторов для местных анестетиков непосредственно в натриевом канале /326, 366, 560/. В итоге оставалось неясным, как анестетик блокирует канал -при прямом взаимодействии с ним или через события в липидном бислое.
Для выявления эффекта генерализации и оценки ее функциональной роли было необходимо проанализировать структурное состояние мембран при строго специфическом взаимодействии регуляторного лиганда (гормона, медиатора) с мембраносвязанным рецептором. К 1973-1974 г.г. мы уже располагали некоторой информацией о рецепторноопосредованном влиянии гормонов и других биорегуляторов на физические свойства мембран, преимущественно эритроцитарных /73, 82, 171, 553/.Б то же время из-за высокой степени гетерогенности по типу клеток оставалась невыясненной возможность рецепторної! индукции генерализованных перестроек нейрональных мембран мозга биогенными аминами. Косвенным указанием на вероятность подобного процесса могла бы служить активация А/а ,К-АТФазы мозга катехоламинами, описанная рядом авторов / 70, 291, 624/. Кроме того в литературе практически отсутствовали сведения о способности важнейше-
го регулятора углеводного обмена-инсулина - инициировать генерализованные перестройки в плазматических мембранах клеток -мишеней печеночной и жировой ткани.
С точки зрения регуляторной роли мембранных перестроек казалось рациональным проверить практическую ценность основных положений гипотезы на примере какого-либо конкретного физиологического процесса, для которого выраженные функциональные сдвиги не получили объяснения на языке биохимии и биофизики. Одним из таких процессов, которому специалисты в области мембранологии не уделяли достаточного внимания вплоть до 1976-1977 г.г., являлась стадия позднего онтогенеза (старение) центральной нервной системы и прежде всего - си-наптических сетей мозга. Хотя к тому времени возрастные морфологические, нейрохимические и электрофизиологические нарушения в нейронах были уже известны /5, 149, 256/, в литературе не были представлены работы, выполненные на изолированных синаптических мембранах и посвященные сопоставлению их структуры и состояния важнейших функциональных систем у зрелых и старых животных.
Цель и задачи работы. Общая цель работы заключалась в том, чтобы оценить правомочность тезиса о многообразии мембранных конформаций (и, естественно, множественности функциональных ответов) в зависимости от природы и/или концентрации регуляторного лиганда (принцип структурно-функциональной специфичности перестроек). Эту цель предполагалось достигнуть в ходе реализации следующих конкретных задач:
I. Выяснить, являются ли кооперативные термические переходы универсальным свойством плазматических мембран вне зависимости от содержания в них холестерина.
На возбудимых мембранах нервных окончаний мозга определить относительную роль перестроек белковой, липидной фаз и специализированных рецепторов в эффекте блокады натриевых каналов местными анестетиками из класса третичных аминов.
С учетом возможной ' рецепторной инициации и структурной генерализации в системе гормон (медиатор) - мембрано-связанный рецептор провести анализ:
а) активации Na ,К-АТФазы нейрональных мембран биоген
ными аминами,
б) взаимодействия инсулина с изолированными плазмати
ческими мембранами печеночных и жировых клеток.
4. В рамках практической проверки тезиса о структурно-
функциональной специфичности мембранных перестроек устано
вить, сопряжены ли известные возрастные нарушения функций
центральной нервной системы с изменениями структурной орга
низации синаптическйх мембран и конформации встроенных в них
ключевых рецепторов и ферментов.
Научная новизна работы отражена в следующих положениях, выносимых на защиту:
1, Плазматические мембраны животных клеток (эритроцитов,
жировой ткани, синаптосом мозга), несмотря на высокое содер
жание холестерина, способны претерпевать термические коопе
ративные перестройки, предположительно инициирующиеся в без-
холестершовых зонах бислоя. Это свидетельствует о потенци
альном значении липида плазматических мембран для передачи
информации в клетке по механизму структурного дальнодействия.
2. Локальные анестетики из ряда третичных аминов при
низких концентрациях вызывают глножественные структурные пере-
ІЗ ходы в синаптических мембранах мозга, инициируемые от нескольких центров связывания высокого сродства и не захватывающие липидный бислой. Блокада натриевого канала в синаптосо-мах осуществляется благодаря взаимодействию анестетиков с самим каналом или его ближайшим окружением. Уменьшение микровязкости липидного бислоя наблюдается при значительно более высоких концентрациях третичных аминов и не сопровождается массированными изменениями конформации мембранных белков. Эти результаты служат аргументом в пользу представлений об избирательном, рецепторноподобном механизме локальной анестезии.
3. Стереоспецифическое взаимодействие инсулина с инсу-
линовыми рецепторами вызывает структурную перестройку в плаз
матических мембранах печеночных и жировых клеток, влияющую на
состояние ^-адренорецепторов (конформацию и/или реактивность
функциональных химических групп), что указывает на генерали
зованный характер перехода. По аналогичному механизму осу
ществляется регуляция У/а,К-АТФазы нейроналышх мембран моз
га норадреналином и серотонином - через «/-адренергические
и серотониновые рецепторы, соответственно.
4. При старении животных происходит структурная реорга
низация синаптических мембран мозга в направлении разрыхления
и снижения микровязкости, что может быть связано с увеличени
ем содержания лизолецитина. Структурная реорганизация носит
плейотропный характер и приводит к модификации аллостеричес-
ких свойств мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы, росту
плотности уабаиновых рецепторов, изменениям конформации
и/или внутримембранной ориентации м -холинергических и й-
адренергических постсинаптических рецепторов. Полученные
14 данные позволяют прийти к выводу о существенной роли мембранной перестройки в возрастных нарушениях нейрональных функций.
Анализ всего экспериментального материала позволяет отдать предпочтение представлениям о многообразии конформаций мембраны как основе специфичности физиологического ответа.
Теоретическое значение диссертации вытекает из новизны приведенных выше положений. Работа дает начало новому направлению - изучению структурно-функциональной специфичности мембранных перестроек как биофизическому пути тонкой регуляции активности клеток. Отличительной чертой этого направления является комплексный подход к проблеме регуляторної роли структурной лабильности мембран: исследования физиологических реакций (например, активности У/а -канала) с одновременным анализом биофизических параметров (физических свойств липида, конформаций суммарного белкового фонда и отдельных макромолекул) на одном и том же функционально-полноценном тест-объекте для получения информации о том, какая из конкретных перестроек ответственна за данный физиологический эффект.
Практическое значение. Полученные в диссертации доказательства прямой блокады третичными аминами натриевых каналов синаптических мембран без вовлечения в этот процесс ли-пидного бислоя в совокупности с ранее известными электрофизиологическими данными для каналов периферических нервных волокон содействуют разработке теоретических основ синтеза новых местных анестетиков, исходя из рецепторной, а не унитарной теории анестезии. Для медикобиологических исследований представляются важными следующие закономерности, обнаруженные в плазматических мембранах печени и свидетельствующие о потен-
циальных путях нарушения гормональной регуляции при атеросклерозе: структурная реорганизация плазматических мембран печени при экспериментальной гиперхолестеринемии, сопровождающаяся ростом относительного числа центров связывания J2>-адренергического антагониста и изменением взаимодействия между инсулиновыми и jS-адренергическими рецепторами.
Установление возрастной структурной реорганизации в синаптических мембранах мозга, обусловленной накоплением ли-золецитина и ведущей к генерализованной модификации ключевых ферментов и рецепторов, способствует формированию теории старения центральной нервной системы как одного из важнейших разделов геронтологии. Представляется перспективншл поиск новых гериартрических лекарственных средств, действие которых направлено на снижение уровня лизолецитина в мозговой ткани.
Развитые в работе подходы к селективной оценке конфор-мационного состояния конкретного маркерного фермента или рецептора в гетерогенной многокомпонентной мембранной системе могут быть использованы в биохимических и фармакологических исследованиях, выполняемых на синаптосомах или гомогенатах мозговой ткани.
Результаты, относящиеся к кооперативным свойствам ли-пидного бислоя мембран с высоким содержанием холестерина, используются в пособии "Биофизика", утвержденном МЗ СССР в качестве учебника для студентов медицинских институтов /46/.
Разработанные нами методы детектирования структурных перестроек мембран по их детергентоустойчивости, чувствительности к протеолитическим ферментам, содержанию поверхностных и скрытых 5/А-групп целесообразно применять для скрининга физиологически-активных соединений. Эти методы
оказались полезными для решения ряда практических задач в гормонально-биохимическом отделе ЦНШІ Белорусского института усовершенствования врачей и в лаборатории токсикологии института санитарии и гигиены МЗ БССР.
В исследованиях, представленных в диссертации, принимали участие следующие сотрудники: к.б.н. Р.Д.Адзерихо, к.б.н. Т.И. Лыскова, Н.А'.Новицкая, к.б.н. И.М.Окунь, А.А.Ракович (Институт фотобиологии All БССР), К.И.Буланова, Е.И.Беляева, к.б.н. А.А.Милютин (сектор геронтологии АН БССР), к.м.н. И.Б.Лившиц, И.Л. Корнеева (Институт усовершенствования врачей БССР).
Плазматические мембраны жировых клеток
Существование таких зон следует уже из неодинаковой смешиваемости холестерина с разными фосфолипидами, ведущей к его неоднородному распределению в многокомпонентных липидных системах (см. обзор 489). Скорее всего именно неоднородностью распределения объясняются результаты Танака и Ониши, показавшие, что спинмеченный фос-фатидилхолин, включенный в мембрану целого эритроцита, доступен для парамагнитного гасителя и обнаруживает термические переходы при 18 и 33С, в то время как фосфатидилсерин "запрятан" и сигнализирует только о переходе при 30С /573/. Есть основания полагать, что осмотический разрыв эритроцита происходит как раз в тех участках мембраны, в которых невелико содержание холестерина /172/, и это обстоятельство объясняет четкий излом при 20С, характерный для аррениусо-ВОЁ зависимости скорости гипотонического гемолиза /172/. На основании низкой чувствительности белковой флуоресценции мембран к тушителям - спинмеченным андростанам и высокой эффективности меченых стеаратов Баллах с сотрудниками /190/ сделали вывод об удаленности холестерина, с которым легко смешивается андростан, от интегральных белков. Однако было бы преждевременно утверждать, что безхолестериновые зоны принадлежат исключительно аннулярному липиду, ибо, как уже говорилось, неравномерное распределение холестерина возможно и в чисто липидных системах. Кроме того, кооперативность переходов в "кольце" довольно низка. Между тем, резкость наблюдавшихся нами изломов и прямые оценки методом комбинационного рассеяния /598/ указывают на высокую кооперативность перехода в области 20С. Почему же перестройка в безхолестери-новои зоне липида не проявляется в типичном эндотермическом эффекте? Одно из объяснений - малый размер соответствующих доменов в интактной мембране с изменениями энтальпии ниже, чем порог чувствительности у калориметра. Но,как справедливо подчеркивают Ивков и Берестовский /59/, чувствительности вполне должно было бы хватать у метода рентгеновской диффрак-ции, которая позволяет оценивать упорядоченность в комплексе уже из семи вытянутых углеводородных цепей. Мы, следовательно, вынуждены признать, что в эритроцитарной мембране наряду с классическими фазовыми переходами возможны кооперативные переходы иного рода, наблюдающиеся независимо от содержания холестерина в липиде. Такой вывод тем более обоснован, что в целом ряде других мембран животного происхождения даже при низкой природной доле холестерина в бислое, например, в митохондриях и микросомах, истинный фазовый переход разыгрывается на десятки градусов ниже, чем резкие структурные аномалии, выявляемые рядом физических и энзимологи-ческих тестов (см. обзоры 59, 489). В настоящее время, пожалуй, единственная физическая теория, способная дать конкретную трактовку приведенным выше противоречивым фактам, - это идея о метастабильных состояниях (липидных кластерах), возникающих в результате белок-липидных и липид-липидных взаимодействий /393/. В течение жизни кластера его молекулярные компоненты движутся как единое целое и имеют относительно упорядоченную структуру, которая однако отличается от твердокристаллической. Трансформации между разными видами кластеров, изменения их числа, межмолекулярные взаимодействия в принципе могут дать типичные изломы по микровязкости, регистрируемые спиновыми и флуоресцентными зондами, но не будут протекать как истинный переход кристалл-жидкий кристалл.- Хотя этот механизм уже довольно давно предложен для термических 20-градусных перестроек в тенях эритроцитов /499/, однозначности интерпретации трудно добиться из-за исключительной сложности системы. В последние несколько лет стало вырисовываться еще одно направление исследований, которое в перспективе, возможно, прояснит ситуацию. Присутствие донорных и акцепторных групп во многих липидах способствует образованию межмолекулярных водородных связей, например, между гидроксильными группами сфинголипидов и эфирной или амидной связями глицеро- и сфинголипидов. Это усиливает тенденцию к самоассоциации и уменьшает электростатические взаимодействия с белками /195/. В результате формируются домены со специфическим липидным составом в разных зонах бислоя и повышается вероятность локальных кооперативных перестроек с несколько необычными свойствами. Сюда относится прежде всего переход от ламеллярной жидкокристаллической фазы в гексагональную при температурах на 10-20 выше области истинного "плавления". Весьма важно, что фазы мало отличаются от микровязкости, а переход имеет низкую энтальпию. Еще один вид перестройки - формирование инвертированных мицелл, зажатых между монослоями липида /195/.
С учетом сказанного не кажется удивительным, что эри-троцитарная мембрана претерпевает не одну, а несколько структурных реорганизаций при плавном смещении температуры среды. Как следует из рис. 1.4, при нагревании "теней" в интервале 8-80С с последующим измерением светорассеяния и скорости протеолиза при 30С, наблюдаются двухфазные необратимые изменения: вначале при 35-50С, а затем при 60-70С. Хорошая корреляция между данными этих независимых методов указывает на два необратимых перехода. Первый из них казался наиболее интересным, поскольку начинается вне области тепловой денатурации белка. Кроме того, по литературным сведениям инкубация теней при 37С восстанавливает барьер проницаемости (нарушенный при гемолизе) для низкомолекулярных соединений, например, глюкозы /352/. Возникло предположение, что ингибирование протеолиза осуществляется именно по такому механизму: трипсин, ранее проникавший внутрь тени через разрьшы, теряет такую возможность после термического "запечатывания" дефектов и теперь способен переваривать лишь те белки, которые находятся на наружной стороне мембраны. Действительно, если подобный опыт ставить на ультразвуковых фрагментах, скорость протеолиза возрастает, но переход при 35-50С более не выявляется, поскольку величины дефектов столь значительны, что они не закрываются при нагревании. В то же время одинаковая чувствительность фрагментов к трипсину в указанном температурном диапазоне свидетельствует против участия белков в переходе, ответственном за изменения светорассеяния и проницаемости для трипсина.
Полиэкстремальное влияние местных анестетиков на синаптические мембраны мозга
Следует подчеркнуть, что приведенные электрофизиологические данные удовлетворительно согласуются с моделью прямого взаимодействия анестетик - канал, но не могут рассматриваться в качестве решающего доказательства модели. Вполне возможны и альтернативные представления,. в которых соответствующие структуры канала (фильтры, сенсор, ворота) претерпевают множество конформациоыных переходов в зависимости от степени и качества изменений в лилидном бислое мембраны и/или в микроокружении натриевого канала.
Таким образом, к началу наших работ, да и в настоящее время равноправное положение занимает унитарная (единая) теория анестезии, основанная на идее о неспецифическом изменении физических свойств нейрональных мембран в присутствии общих или местных анестетиков. Единая теория исходит из принципа Мейера-Овертона-Муллинза, согласно которому наркоз наступает тогда, когда любое химически инертное вещество достигает в гидрофобной зоне мембраны определенной молекулярной концентрации и объема /447, 457/. Внедрение чужеродных молекул ведет к расширению мембраны, а критический уровень расширения - к блокаде натриевой проницаемости. Согласно последним подсчетам общее изменение объема эритроцитарных мембран действительно совпадает с ван-дер-ваальсо-вым объемом молекул, включенных в бислой, если внести поправку на одновременное снижение его толщины /585/. Гипотеза критического объема согласуется также с хорошо известной способностью анестетиков вызывать расширение липидных монослоев и растяжение мембран эритроцитов, что определяет защиту от гипотонического гемолиза для большого числа поверхностно-активных соединений /540/. Утвеждалось даже, что существует хорошая корреляция между концентрациями анестетиков, вызывающих блокаду проводимости на периферических нервных волокнах и тормозящих гемолиз у эритроцитов. Однако строгость такой корреляции представляется сильно преувеличенной (см. ниже). С позиций гипотезы расширения казалось естественным ожидать, что сжатие мембран внешним высоким давлением должно обращать анестезию. Это в целом хорошо подтверждается для общих газообразных и гораздо менее четко - для местных анестетиков./560, 606/.
Феноменологическая картина расширения гидрофобной зоны еще ничего не говорит о том, какие компоненты мембраны, белки или липиды ответственны за увеличение объема, каким образом подобная структурная модификация приводит к блокаде натриевого канала. Широкое использование физических методов исследования на моделях (невозбудимых природных и искусственных липидных мембранах) позволило сформулировать несколько молекулярных гипотез анестезии, объясняющих увеличение объема событиями в липидной фазе: ростом текучести или фазовым переходом. Вызванное фармакологическими препаратами явление "фпюидизации" мембран детально описано в ряде обзоров /90, 128, 361, 540/. Ограничимся поэтому лишь основополагающими исследованиями. Первые работы были выполнены методом ПМР на системе бензиловий спирт - мембраны эритроцитов. Меткаф с сотр. .(см. обзоры /90 , 444/) показали, что подвижность протонов спирта при низких его концентрациях (3 Ш) уменьшается в присутствии эритроцитарных мембран благодаря включению анестетика в липидный бислой. Дальнейшее повышение концентрации вплоть до 60 мМ сопроііздает-ся ростом подвижности, в то время как литические дозы вновь ведут к иммобилизации. Опыты на липидах, экстрагированных из мембран, дают сходные зависимости, однако не наблюдается участка повторной иммобилизации на дозовой кривой. На этом основании предполагалось, что спирт и липид конкурируют за места связывания с мембранным белком. При литических концентрациях анестетика за счет нарушения бе-лок-липидных взаимодействий и/или конформационного перехода в белке на поверхности последнего появляются центры, связывающие ароматические кольца спирта (иммобилизация). В области же низких доз рост подвижности протонов отражает раз-упорядочение липидов. Аналогичные эффекты были выявлены для других спиртов и для катионного анестетика лидокаина при использовании спиновых и флуоресцентных зондов /271, 334, 443, 496/. Наконец, опыты на липосомах и пленках при добавлении разнообразных анестетиков показали, что все они способны увеличивать текучесть искусственных липидных мембран /444/. Ряд авторов рассматривает увеличение подвижности липидных молекул как следствие градуального "разжижения" мембраны. Однако к тому же конечному результату привел бы и индуцированный анестетиками фазовый переход мембраны из твердого в жидкокристаллическое состояние /585/.
Это может быть следствием снижения температуры фазового перехода в липиде. Подобный эффект действительно зарегистрирован для ряда модельных мембран /90/. По данным Хилла /325/ при содержании в мембранах из дипальмитоилфосфатидилхолина 0,044 моля любого анестетика на моль липида температура фазового перехода уменьшается на 1С. Октанол и пропанол в анестетических концентрациях понижает температуру фазового перехода фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина на 5С. Разумеется, лучшим приближением к природным мембранам являются липосомы, содержащие несколько типов фосфолипидов. Для таких мембран характерно сосуществование и твердых и жидких участков (фазовое разделение липида) /219/. По мнению Тра-делла /585, 586/, анестетики, увеличивая долю липида в жидкокристаллической фазе, снижают латеральное фазовое разделение, т.е. уменьшают размеры относительно твердых липид-ных кластеров. Возможно, что именно с этим связано вызванное общими анестетиками уменьшение размеров элементарной кооперативной ячейки в липосомах из дипальмитоилфосфатидилхолина /455/, а также обнаруженное недавно ускорение диффузии АНС под влиянием третичных аминов через липидные и синап-тические мембраны .(появление многочисленных небольших кластеров увеличивает долю зон, проницаемых для зонда) /587/. Каким образом дезорганизация бислоя, возникшая при градуальном снижении упорядоченности или в результате фазового перехода, блокирует функцию натриевого канала? По Традел-лу /585/ для перехода канала в открытое состояние соответствующей белковой структуре необходимо расшириться, чему способствует упорядоченное липидное окружение (в состоянии геля), занимающее меньший объем и обладающее достаточной сжимаемостью.
Индуцированные инсулином структурные перестройки в плазматических мембранах печеночных и жировых клеток
При реакция не идет и наблюдается полное неконкурентное торможение. При 0 5 1 реакция идет лишь частично по сравнению с вариантом без ингибитора (неполное неконкурентное торможение). В нашем случаем расчет дает два значения К и jb : К =5,2 10-5 моль/л, =0,5 при низких и К З.З Ю-4 моль/л,р=0 при высоких концентрациях новокаина. Учитывая, что коэффициент Хилла для дозовой кривой ингибирования (рис. 2.7 Б) составляет величину меньше единицы (0,77+0,015), кажется логичным допустить, что молекула мембранной АХЭ обладает двумя равноценными аллостерическими, новокаин-связывающи-ми центрами, взаимодействующими между собой по механизму отрицательной кооперативности. Связывание новокаина с первым центром высокого сродства (К"=5,2 10 моль/л) переводит соседний в состояние с низким сродством (=3,3 10 моль/л), причем посадка на второй центр полностью выключает активность . Отметим, что после солюбилизации детергентом величина п падает до 0,5, что в рамках той же модели можно интерпретировать как усиление отрицательных кооперативных взаимодействий между центрами связывания анестетика в результате снятия контроля со стороны мембранного микроокружения. Разумеется, ввиду ограничений, присущих кинетическому анализу, нельзя полностью исключить и такой ситуации, когда указанные центры независимы и обладают исходно разным сродством к ингибитору. Надежность нашей интерпретации повышается благодаря соответствию с данными, полученными ранее на АХЭ электрических органов рыб /278/. На этой системе также установлено ингибирование новокаином, которое интерпретируется в рамках модели о наличии в молекуле АХЭ двух новокаин-связывающих центров, аллостерически взаимодействующих между собой и отличных от каталитических.
Возможно, что кооперативные взаимодействия реализуются не только между центрами, комплексирующимися с анестетиком, но и между новокаин-связывающими и каталитическими центрами АХЭ. Так, в присутствии ІСГ4 моль/л новокаина устраняется положительная кооперативность между субстрат-связывающими центрами: коэффициент Хилла для кривой "активность-J(концентрация ацетилхолина)" снижается от 1,22 до 0,85. Все это указывает на индуцированное анестетиком изменение конформации фермента»
Существует ли какая-либо связь между мембранными переходами, выявленными по детергентоустойчивости и изменениями конформации двух исследованных ферментов? Щелочная фосфатаза и ацетилхолинэстераза могут быть как центрами, связывающими анестетик и инициирующими мембранные перестройки, так и индикаторами событий,начинающимися в мембране за пределами самой молекулы фермента. Во всяком случае,способность низких концентраций новокаина полифазно влиять на детергентоустойчи-вость и ферментативную активность синаптических мембран позволяет говорить о множественности мембранных перестроек,вызываемых одним и тем же эффектором, и о существовании целого набора центров связывания, резко различающихся по сродству. Подобный вывод подтверждается последними сведениями о взаимодействии местных анестетиков с искусственными и природными мембранами, а также данными о дифференциальной чувствительности митохондриальных ферментов к спиртам и третичным аминам. Так, уже на простых ламеллярных дисперсиях яич-ного фосфатидилхолина методом Н-ЯМР выявлены два типа центров - слабо и прочно связывающие дейтерированные новокаин и дикаин. В свою очередь центры высокого сродства неидентичны для заряженной и нейтральной форм амина, причем заряженные располагаются ближе к границе раздела фаз мембрана-вода /199/. С помощью фотоактивного аналога новокаина - прокаина-зида, не отличающегося от новокаина по сродству к мембранным компонентам, Премачандра и др. /487/ показали, что светоинду-цированные ковалентные сшивки фиксируют 60-70$ добавленного анестетика в комплексах с белком и лишь 30$ - с липидом теней эритроцитов. Предпочтительное связывание идет с глико-протвидами ж белками полосы 3,
Наконец, недавно продемонстрировано, что електротранспортная цепь субмитохондриальных частиц из печени крыс и сердца быка весьма неоднородна по своей чувствительности к анестетикам. Например, концентрации полумаксимального инги-бирования тетракаином в 250 раз ниже у НАДН-оксидазы, чем у цитохром с-оксидазы. Обнаружены следующие "мишени" для спиртов, третичных аминов и хлорпромазина: на комплексах П и Ш, между комплексом П и цитохромом с и особо чувствительный центр на комплекс I или в его микроокружении /223/. Отметим также, что способность щелочной фосфатази к полифазным изменениям каталитических свойств при градуальном смещении концентрации анестетика не является чем-то уникальным, а характерна и для других мембранных ферментов. По данным лаборатории Хауслея /298/ стимулированная глюкагоном аденилатцик-лаза печеночных мембран ингибируется низкими дозами фенобарбитала и/или пентобарбитала; при дальнейшем росте концентрации анестетиков ее активность увеличивается и вновь снижается, причем эти эффекты не сопровождаются модификацией текучести лйпидного бислоя.
Структурные особенности изолированных синаптических мембран мозга у животных разного возраста
Последующее добавление анестетиков не может заплавить слишком большие разрывы, возникающие при ультразвуковом дроблении. Отсюда и неэффективность спиртов и новокаина. В главе I было показано, что "заплавление" мембранных дефектов может быть достигнуто инкубацией теней при 34-45С. В соответствии с предлагаемой интерпретацией после прогревания при 37С и снижения скорости протеолиза (см. рис. 1.4) анестетики более не тормозят перваривание. Недавно Джонсон /349/, оценивая замыкание теней по количеству захваченного из раствора гемоглобина при ЮС, обнаружил, что антигемолитические концентрации хлорпромазина, дибукаи-на, тетракаина, пентобарбитала, этанола, бутанола, бензилового спирта усиливают закрытие мембранных дефектов подобно нагреванию при 37С. Как и в нашей работе, был сделан вывод, что улучшение замыкания теней связано с повышением текучести бислоя под действием анестетиков.
Итак, отсутствие влияния анестетиков на протеолитичес-кую чувствительность ультразвуковых фрагментов и запечатанных теней означает, что топография, конформация и динамические свойства основного фонда белков в мембране эритроцита в присутствии спиртов и новокаина остаются неизменными.
Еще одним подходом к оценке конформационного состояния белка может быть определение числа поверхностных и скрытых Н-групп. Хорошо известно, в частности, что при денатурации глобулы в растворе стерически надоступные Н-группы становятся демаскированными /146/. Сложнее обстоит дело с биологическими мембранами, в которых белок контактирует с липид-ным окружением и соседними макромолекулами. Впервые оценку числа экспонированных тиолов в изолированных мембранах /174/ (тромбоцитов) провели Андо и Стейнер. В ряде работ на сарко-плазматическом ретикулуме реактивность Н-групп служила критерием конформационной перестройки Са-АТФазы под влиянием Са+ и АТФ /427/. Предпринимались попытки с помощью такого же подхода выявить изменения белков в мембране аксона при электростимуляции /429/.
В связи со сказанным казалось оправданным проанализировать распределение сульфгидрильных групп синаптических мембран в присутствии анестетиков /134, 135/. Из рис. 2.12 видно, что реакция непроникающего Н-реагента 5,5-дитиобиснитро-бензойной кислоты (ДТНБ) с Н-содержачими белками интактных мембран практически выходит на плато к 25-30-й минуте инкубации. За это время ДТНБ титрует 3,0+0,2 моль/л Н-групп на 10 г белка, что составляет 30,6+3% от общего числа остатков, которое выявляется в 1% ШР-Мд. Поскольку синаптическая мембрана несет суммарный отрицательный заряд, анионный ДТНБ за счет электростатического отталкивания может выявить не все Н-грушш. Действительно, увеличение ионной силы солями 7/аС1 или КСІ (рис. 2.13) сопроізждается увеличением числа титруемых остатков. К аналогичному результату приводит и удаление поверхностных зарядов обработкой (1,5ч. при 37С, рН 7,4) синаптических мембран (10-15 мг белка/мл) фосфолипазой С (100 мкг/мл) с последующим их переосаждеиием (1000000 , 30 мин). После такого воздействия число выявляемых групп возрастает в среднем на 50%. Известно далее /503/, что ДТНБ реагирует с депротонированной формой сульфгидрильных остатков, и это накладывает дополнительные ограничения на титруемость при рН 7,4. Увеличение рН до 8,5 (рК ионизации Н-групп = =7,5-8) позволяет дополнительно зарегистрировать 1,5+0,1 моль/л Н-групп на 1(Г г белка. Различные тиоловые реагенты обладают неодинаковой специфичностью по отношению к различным классам мембранных SH-rpynn /174/. Мы отдельно определяли те из них, которые способны реагировать как с непроникающими ДТНБ, так и с проникающими УУ-этшшалеимидом (НЭМ) (см. -."Методы"). В интактной мембране НЭМ блокирует в среднем 1,7 моль из 3 поверхностных и только 1,2 моля из 6,8 скрытых групп, которые выявляются с помощью ДТНБ.
Перейдем теперь к влиянию анестетиков. Из табл. 2.6 следует, что третичные амины и спирты в соответствии с их гидрофобностью увеличивают титр поверхностных тиолов. Так, катионные анестетики по своей эффективности, измерявшейся при концентрации 10 ммоль/л, располагаются в ряду: новокаин кокаин бензокаин тз тримекаин гз кеталар (кетамин) пиромекаин дикаин. Ряд для спиртов выглядит следующим образом: метанол этанол изопропанол бутанол. Прежде всего мы исключили тривиальные артефакты, связанные с возможным вмешательством указанных соединений в саму реакцию Н-групп с ДТНБ, например, благодаря росту гидрофобности среды /146/.
Контрольные опыты с цистеином и глутатионом показали, что третичные амины (10 ммоль/л) и спирты (до I моль/л) не изменяют ни скорости этой реакции, ни молекулярного коэффициента экстинции продукта 4-нитротиофенолята, ответственного за оптическую плотность при 412 нм (Д412 Следовательно, вызванное анестетиками увеличением Д412 обусловлено именно экспонированием мембранных тиолов для ДТНБ .