Введение к работе
Актуальность проблемы, Проблема изучения динамических изменений структуры ДНК и ДНП связана с вопросами функционирования генома, при которых происходят изменения как вторичной структуры информационной макромолекулы, так и третичной структуры ЛНК и ее комплексов с белками. Становится очевидным, что разнообразие конформаций двуспиральноя структуры, локальные изменения структуры макромолекулы ЛНК. в составе хроматина определяется как первичной последовательностью ЛНК, так и факторами среды и взаимодействием со сложным комплексом гистоновых белков в нуклеосоме ( Drew H.R.,Travers А.А.,1984 ; Richmond.Т.J.,et al.1984).Актуальность проблемы определяется в частности и тем, что строение нуклеосомы , основной структурной единицы хроматина, а именно трехмерная укладка полипептидных цепей гистонов и строение связывавших контактов, находится еще в стадии изучения ( King A. et al,1980, Mlrzabekov A.D. et al. I960, Mc Chee J.D. et al,1980; Bentley A.L. et al.1984).
В последнее время предполагается, что ДНК-гистоновые взаимодействия в хроматине осуществляются как с помощью электростатических взаимодействий заряженных аминокислот с фосфатами, так и с помощью водородных связей между аминокислотами в а-спиральных участках белков с основаниями ДНК. Обнаруженный недавно общий принцип взаимодействия с ДНК регуляторних ДНК-связывающих белков с помощью консервативной а-спиральной структуры ( Takeda Y. et al,1983; Sauer R.T. et al.,1982) поставил вопрос о поиске аналогии и во взаимодействии и строении димерных комплексов октамеров гистонов с нуклеосомной ДНК. Для выяснения общих принципов образования таких комплексов может быть
полезен математический метод определения гомологии аминокислотных последовательностей между гистонаыи эукариот и ДНК-связывающими белками прокариот.
Вместе с тем, для изучения структурных изменений ДНК. и динамических особенностей хроматина .а также построения модели нуклеосомы, включая пространственную структуру гистоновых белков, может оказаться полезным метод спиновых меток и зондов, чувствительный к локальным конформационным изменениям макромолекул. Метод спиновых меток и зондов нашел широкое применение в молекулярной биологии для изучения структурно-функциональных особенностей белков и ферментов и динамики ряда биологических систем ( Мс Connel, et al,1965; Лихтенштейн Г.И.,1974;Кузнецов А.Н. и др., 1974). Однако, применение метода для изучения нуклеиновых кислот после успешного проведения ряда работ (Сухорукое и др. 1970, Slncha et. al., 1979) тормозилось, в связи с трудностью избирательной модификации ДНК спиновыми метками и физико-химическими особенностями комплексов ДНК. с зондами, интеркалируюшиии в двойную спираль. В последнее время ведется разработка новых методов синтеза спиновых меток , зондов ,спин-меченых красителей, что открывает перспективы широкого использования их как модельных аналогов биологически активных соединений I Hong Sun-Joo,Plette L.H.,1975; Robinson В.Н.1979;Криницкая Л.А.,Шапиро А.Б..1977).
Можно было полагать,что развитие метода спиновых зондов и меток позволит получить дополнительные сведения о структурных изменениях ДНК при химических воздействиях, при нормальном и опухолевом росте, действии УФ-и гамма-облучения,которые ранее были изучены
рядом физико-химических методов имануэль, 1974 ;
Круглякова К.Е. .Николаева Н.Н, 1965;Жижина Г.П. 1986,-Уланов Б.П., Шарпатый В.А.,1978). Использование возможностей метода ЭПР в сочетании с другими физико-химическими и биохимиическими методами, по видимому, может дать новые подходы для получения исчерпывающей информации о тек превращениях, которые возникают в макромолекуле при взаимодействии с биологически активными соединениями. Метод спиновых меток может стать также тонким инструментом в изучении ДНК-гисгоновых взаимодействий при исследовании динамических изменений хроматина.
Цель работы. Цель работы состояла в исследовании структурных
особенностей макромолекулы ДНК, ее комплексов с малыми
молекулами, а также динамических изменений структуры ДНК и
хроматина разного происхождения при физико-химических
воздействиях с использованием метода спиновых меток и зондов.
В связи с поставленной целью решали следующие задачи:
1. Разработать новые подходы и выработать количественные критерии
для изучения динамических особенностей структурно-изолированной
макромолекулы ДНК и ДНП - комплекса методом спиновых меток и
зондов.
2. Изучить особенности интеркаляиии спин-меченых производных -
аминмакридинового ряда и использоЕать этот подход для мониторинга
взаимодействия малих, биологически активных молекул с ДНК..
^.Проанализировать конформационные изменения в ДНП нормы и
опухоли под действием факторов среды (мочевины,детергентов,соли> с
использованием жестких, коротких ртутьсодержащих спиновых меток.
4.Выявить особенности организации гистоновых октамеров в нуклеосомах покоящихся и функционально активных тканей.
_ 4 -
5.С использованием математического метода анализа на ЭВМ выявить гомологию аминокислотных последовательностей между гистонами эукариот и ДЖ-связываюшими белками прокариот.
6 Сформулировать обшие принципы построения ДНК-белковых
комплексов у ДНК-свяэываюших регуляторних белков прокариот
и гистонов эукариот .Предложить схему пространственной организации нуклеосомы и гистоновых белков.
7.Разработать метод определения ДНК-белковых сшивок в хроматине
под действием УФ-света для анализа биологич еской активности
химических соединении, обладающих протекторном или
сенсибилизирующим действием.
Научная новизна рабошы.Ь диссертации впервые проведено систематическое изучение особенностей динамической структури нуклеиновых кислот, дезоксирибонуклеопротоидов, л гакже комплексов ДНК с малыми биологически-активными молекулами при различных физико-химических воздействиях с гюмошыа разработанных подходов и приемов, сочетающих метод спиновых меток и зондов с другими физико-химическими методами. Это позволило получить сведения о наличии ряда температурных структурных переходов в ДНК, зарегистрировать ранние предденатурационные изменения динамических характеристик ДНК. Установлено, что гтруктур.чые нарушения обуславливают различия в температурах структурных переходов ДНК нормальных и опухолевых клеток, которые (-ЫЯВЛЯЬТСЯ более резко при действии малых доз гамма-облучения.
Сочетание метода ЭПР и дифференциальной спектроскопии впервые позволило получить данные о том, что интеркаляция крагитоля см-9 аминоакридина в ДНК осуществляется в нейтральной и г, заряженной форме в зависимости от состояния ее вторичной структуры
Использование спин-меченого интеркалирующего красителя позволило обнаружить различия в изменениях структуры ДНК под действием дУФ- и кУФ-света.
Математический анализ аминокислотных последовательностей между гимстонами ИЗ, Н4 эукариот и белком КСго прокариот позволил впервые обнаружить статистически значимую гомологию между ними по критерию, отражающему сходство в первичной струют/уре, и предположить определенную вторичную структуру участков, взаимодействующих с ДНК. Эти данные позволяют предположить возможность общего эволюционного происхождения этих белков, а также общих принципов образования ДНК-белковых комплексов, как с помощью электростатических взаимодействий заряженных аминокислот с фосфатами, так и с помощью водородных связей а-спиральных участков гистонов с основаниями ДНК.
С использованием новых ртутьсодержащих спиновых меток проведено изучение динамических особенностей и пространственной структуры ДНП нормальных (тимус теленка) и опухолевых клеток (асцитныя рак Эрлиха) под действием факторов среды, что позволило обнаружить различия в конформационных изменениях в районе сульфгидрильных групп ДНП нормы и опухоли.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили разработать подходы к изучению структурных изменений нуклеиновых кислот методом спиновых меток и зондов, выявить количественные критерии изменения структуры ДНК при физико-химических воздействиях и при опухолевом росте. Эти подходы могут быть широко использованы при анализе структурных особенностей биополимеров, комплексов ДНК с белками и малыми биологически активными соединенями.
Установлено, что сочетание метода ЭПР и дифференциальной спектроскопии для изучения взаимодействия см 9-аминоакридина с ДНК и образования комплексов ДНК с малыми биологически активными соединениями, позволяет получить взаимодополняющую информации о структурных особенностях изучаемых комплексов и их изменениях при действии дУФ-света.
На основании изучения комплексов ДНК с аминокислотами и фосфолипидами, а также данных о конформаиионных изменениях ДНК при действии дУФ и малых дозах кУФ-света, предложено использовать интеркалирующия краситель ( метод ЭПР и дифференциальной спектроскопии) для мониторинга взаимодействия ДНК с биоло гически-активными соединениями.
Анализ собственных и литературных данных по изучению структуры ДНП нормальных и опухолевых клеток позволил сделать ряд выводов о пространственных соотношениях в нуклеосомах нормальных и опухолевых клеток. Высказан ряд научных гипотез: общем эволюционном происхождении белка репрессора М^го прокариот и гистонов НЗ и Н4 эукариот; предложена схема взаимодействия гистонов НЗ и Н4 с центральными парами ДНК кора, которая может быть использована в качестве рабочей гипотезы в научных экспериментах.
Предложен метод определения ДНК-белковых сшивок в хроматине, образующихся под дєлстеиєм УФ-облучения в присутствии химических соединений, который может служить удобной тест -системой при отборе препаратов -модификаторов zmeo-л. Метод защищен авторским свидетельством.
Апробация работа. Результаты исследований были доложены на IV Международном биофизическом конгрессе іМоскЕа,1972), Симпозиуме
Свободнорадикальные состояния и их роль при лучевом поражении и злокачественном росте (Москва,1972),Х -ом всесоюзном совещании по биологическому действие УФ-облучения ( Горький,1974), V-th International Biophysical Congress (Kopengagen ,1975), Всесоюзных симпозиумах " Магнитный резонанс в биологии и медицине",(Звенигород,1981 , 1982,1966,1969), VII-th Jena Sympozium (Jena ,1975), 1-ом Биохимическом съезде (Москва,1982 ), Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка, 1982), б the СМЕА Symposium on EPR Spectroscopy In Biochemistry (Bratislava" 1988), Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка. 1987), Международная конференция по регуляции и свободно-радикальным реакциям (Варна,1989 ), A FEBS satellite meeting "Molecular Dynamics in Membrane",1980 , а также на конференциях Института химической физики в 1974-1986 годах.
Отдельные фрагменты исследований отражены в монографиях Г.И.Лихтенштейна "Метод спиновых меток в молекулярной биологии",1974, Бучаченко А.Л..Вассерман A.M. "Стабильные радикалы" 1973, Кузнецов А.И. "Метод спинового зонда"1976, Эмануэль Н.М. "Свободные радикалы в биологии " 1979, Розанцев Э.Г."Метод спиновых меток"1979, Кокорин А.И., Пармон В.Н. и др. "Стабильные бирадикалы "1980, Жданов Р.И. "Парамагнитные модели биологически-активных соединений"1981, Ажипа Я.И. "Медико -биологические аспекты применения метода ЗПР ",1983. Bobst A.M."Application of spin lalelllng to nucleic acids",In "spin labelling" V2, 1979; Kamsolova S.G..Postnlkova "Spin labelled nucleic acids".Quarterly Rewlews of Blophysles",1901; B.H.Robinson, H.Tomann at al "EPR and Advanced ESR studies of Biological Systems"Chapter 6"The application of EPR techniques to
the study or UNA" In 1982, in 1953, In 1УЄ5.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 работ.
Яа защиту выносятся следующие основные положения:
1. Разработка подходов к иэучени/ю структурных изменений
нуклеиновых кислот, взаимодействия ЛИК с малыми
биологически-активными соединениями, а также для исследования
пространственной структуры ДНП методом спиновых меток и зондов.
-
Сочетание метода ЭПР и дифференциальной спектроскопии для изучения взаимодействия см Э-аминоакридина с ЛЯК и осразования комплексов ДНК с аминокислотами и фосфолипидами.
-
Исследование и математический анализ на ЭВМ аминокислотных последовательностей гистонов НЗ,Н4 и белков репрессоров прокариот Изучение конформации С-концевого участка гистона НЗ в ДНП нормальных и опухолевых клеток методом спиновых меток. Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, . заключения, приложения и основных выводов.. Каждая глава включает краткий обзор литературы и состояние исследований в соответствующих областях ЭПР. В главе "Приложение" описаны экспериментальные методики и результаты некоторых экспериментов. Общий обьем диссертации IdU страниц. Экспериментальный материал представлен
3S рисунками и 8 таблицами.Список литературы включает 1 работы.