Введение к работе
Актуальность темы^ Ионный транспорт через клеточные и субклеточные мембраны является важной составной частью метаболизма клетки. Важным
элементом как биологических, так и модельных мембран является наличие неперемешнваемых слоев вблизи их поверхности, массоперенос D которых затруднен и осуществляется преимущественно диффузией. При протекании потока ионов через мембрану в неперемешнваемых слоях образуется градиент концентрации ионов, который может существенно влиять на скорость работы транспортной системы (Barry,Піamond,1984 ) . В настоящее время хорошо изучены закономерности образования стационарных градиентов рН на БЛМ. Локальные изменения концентрации ионов могут быть измерены различными экспериментальными методами, что дает возможность оценивать величину ионных потоков через мембрану (Антоненко,Булычев,1991) . Существенный прогресс в изучении кинетики ионного транспорта сняяаи с применением релаксационных методов, и в особенности тех из них, которые основаны на измерении электрических величин (Benz,1989). Однако эти методы, дающие представление о динамике процессов, не применимы напрямую для изучения неэлектроген-ных потоков из-за отсутствия потенциал-зависимых стадий транспорта. Поэтому ионофоры семейства нигерицина, осуществляющие электронейтральный Mef/Hf обмен, изучались на плоских бислойных липидных мембранах только стационарными методами и, соответственно, имеется лишь скудная информация о кинетических константах отдельных стадий работы таких переносчиков. В то же время известно, что благодаря наличию неперемешнваемых слоев, объемные градиенты слабых кислот или градиенты рН на мембране, содержащей различные типы переносчиков, могут трансформироваться в градиенты концентрации катионов щелочных металлов, и наоборот. Электронейтральные ионные потоки, создавая локальные сдвиги рН в неперемешнваемых слоях, могут влиять на работу
электрогенных протонофоров. Таким образом, изучение нестационарных процессов в неперемешиваемых слоях позволяет разрабатывать подходы к исследованию кинетических параметров электронейтрального транспорта ионов. С другой стороны, асимметрия ионного окружения мембраны, возникающая при образовании локальных концентрационных градиентов у ее поверхности, служит одной из причин существенной нелинейности вольт-амперных характеристик электрогенного ионного транспорта (Маркин,Чизмадхев,1974). Несмотря на высокую информативность (Astumian,1993), эффекты, связанные с нелинейностью потенциал-зависимых стадий транспорта до недавнего времени подробно не изучались.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось экспериментальное изучение на модельной бислойной липидной мембране особенностей работы ионофоров в нестационарных условиях, в частности, при образовании и диссипации локальных градиентов ионов в примембранных неперемешиваемых слоях. Основное внимание было уделено взаимодействию электрогенных и электронейтральных ионных потоков в неперемешиваемых слоях в различных нестационарных условиях: при переходных процессах и периодическом изменении электрогенного потока. В число основных задач входила также разработка методов, позволяющих получать информацию о неэлектрогенных ионных потоках путем электрических измерений на БЛМ. Научная новизна работы. В ходе исследований была найдена и теоретически обоснована зависимость профиля концентрации вещества у поверхности мембраны от времени при диффузионном механизме релаксации. Показано, что электронейтральный Kf/H* обмен может изменять проводимость системы мембрана - неперемешиваемый слой при взаимодействии с электрогенным потоком, что дает возможность изучения электронейтральных ионных потоков простыми электрическими методами. Этот методический прием был успешно опробован на примере К*/Н обмен-
ника нигерицина. Показано также, что другим экспериментальным подходом, позволяющим получать информацию о кинетике работы ионофора, является измерение постоянного тока при воздействии- на мембрану переменным электрическим полем различной частоты. Изменение постоянного тока в этих условиях сьязаио с нелинейностью проводимости мембраны а присутствии ионофора. Сделан вывод о существовании локальных нестационарных сдвигов рН, которые распространяются на существенно меньшие расстояния, чем толщина неперемешиваемого слоя, и оказывают заметное влияние на работу ионофора в нестационарных условиях.
Нрактиче екая значимость работы. Построенная модель диссипации локальных сдвигов рН может использоваться в дальнейших исследованиях транспорта ионов в неперемешиваемых примембранных слоях, а также работы неэлектрогенных ионофоров. Результаты воздействия переменным электрическим полем на работу ионофоров могут быть использованы при разработке методов изучения ионного транспорта через модельные и природные мембраны, а также механизмов превращения энергии в мембранных системах.
Апробация работы,.. Результаты диссертационной работы докладывались на всероссийском совещании "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1494) и на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им . Л .Н.Белозерского MJУ (Москва, 1994).
Публикации. По материалам исследований опубликованы 3 печатные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литерат'урм и трех главах, описания материалов и методов исследования, изложения результатов в трех главах, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.