Введение к работе
Актуальность темы диссертации
Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) осуществляет функции внеклеточного депонирования и транспорта многих эндогенных лигандов: жирных и желчных кислот, аминокислот, порфиринов, - а также катионов металлов (Zn2*, Со2+, Си2+) и различных ксенобиотиков - лекарственных средств и ядов (Peters, 1975; Kragh-Hansen, 1981, 1990; Herve et al, 1994). Универсальность связывающих свойств альбумина обусловлена наличием нескольких гидрофобных карманов (Carter & Но, 1994), а также высокой конфор-мационной лабильностью молекулы ЧСА, позволяющей подстраивать конформацню аффинных центров к структуре лиганда (Нопоге, 1990). Для печеночной и почечной недостаточности характерно снижение связывающей способности ЧСА (Sjoholm et al, 1976; Ландау, 1985; Viani et al, 1992; Миллер, 1993), что способствует развитию синдрома эндогенной интоксикации и снижает эффективность применяемых лекарственных препаратов. В настоящее время обсуждаются два основных механизма дисфункции ЧСА при патологии - блокирование аффинных центров эндогенными метаболитами и структурные изменения молекул альбумина. Ряд ингибиторов транспортной функции ЧСА при почечной недостаточности удалось идентифицировать (Mabushi & Nakahashi, 1988; Nlwa et al, 1988), тогда как данные о модификации структуры альбумина при заболеваниях фрагментарны и противоречивы - от отсутствия конформационных изменений белка (Sjoholm et al, 1976; Kober et al, 1978) до обнаружения частично денатурированного альбумина (Троицкий с соавт., 1986, 1991).
Таким образом, комплексное физико-химическое исследование структуры альбумина при печеночной и почечной недостаточности, направленное на выяснение молекулярных механизмов дисфункции ЧСА при данных заболеваниях, является актуальной задачей современной биофизики и позволит использовать структурно-функциональное состояние молекулы альбумина для оценки степени развития эндогенной интоксикации в организме.
Снизь работы с крупными научными программами, темами
Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы Института биоорганической химии АНБ "Разработка моделей детоксгосации организма при патологиях, связанных с нарушениями белкового метаболизма".
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования явился сравнительный анализ структуры и связывающей способности ЧСА здоровых доноров и больных с хронической почечной и печеночной недостаточностью - заболеваний, при которых показано нарушение транспортной функции альбумина. Поставленная цель включала решение следующих задач:
выбор метода выделения белка, сохраняющего нативнуго структуру и состав прочно-связанных лигандов альбумина в норме и при заболеваниях;
сравнительный анализ вторичной структуры и особенностей глобулярной упаковки альбумина в норме и при заболеваниях, а также оценка конформациошюй лабильности молекулы ЧСА при изменении рН среды и температуры;
сопоставление связывающей способности основных аффинных центров альбумина здоровых доноров и пациентов;
оценка обратимости модификации структуры и связывающей способности альбуминг при заболеваниях;
- оценка роли длинноцепочечных жирных кислот - неспецифического стрессовогс
фактора - в конформационных изменениях альбумина при заболеваниях.
Научная новизна полученных результатов
Впервые проведен комплексный сравнительный анализ вторичной, третичной струк туры, гидратации и связывающей способности сывороточного альбумина больных і хронической печеночной и почечной недостаточностью.
Показано, что различные методы выделения ЧСА в разной степени модифицируюсь) нативную структуру и лигандирование. Наиболее адекватным методом выделени; альбумина в норме и при патологии признано полиэтиленгликольное фракционировани плазмы крови.
Установлено, что степень спирализации молекул альбумина в растворе не изменяете при хронической почечной и печеночной недостаточности. В лиофилизовашюм состоя нии образцы ЧСА печеночных больных характеризуются аномально высоким содержг нием Р-структуры. В растворах альбумина больных с печеночной недостаточность! обнаружено увеличение количества и времени корреляции связанной воды.
Показано увеличение термостабильности "патологических" альбуминов, снижени их способности к индуцированным рН конформационным переходам в диапазоне рН ( 10, а также снижение сродства к лигандам четырех основных аффинных центров молею лы альбумина, более выраженное при печеночной недостаточности.
Продемонстрировано, что ряд спектральных и термодинамические особенносте "патологических" альбуминов не устраняются после делигандирования белка и і являются следствием нагрузки ЧСА длиннонепочечными жирными кислотами.
Выявлена зависимость структурно-функциональных свойств ЧСА больных хроні ческим пиелонефритом от длительности жизни пациентов па программном гемодиализ!
Практическая и экономическая значимость полученных результатов
Данные о снижении связывающей способности различных аффинных центров ЧСА при печеночной и почечной недостаточности могут быть использованы для коррекции
дозировки лекарственных средств. Сведения об обратимости модификации структуры и транспортной функции альбумина при патологии могут служить основой для выбора сорбционной либо трансфузионной стратегии детоксикационнон терапии. Представленные результаты также могут быть использованы для прогноза выживаемости уремических пациентов на программном хроническом гемодиализе.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
- метод выделения ЧСА, основанный на полиэтилентликольном фракционировании
плазмы крови, сохраняет нативную структуру и лигандную нагрузку белка и наиболее
адекватен для изучения структуры и функции альбумина в норме и при патологии;
альбумин больных с хронической печеночной и почечной недостаточностью характеризуется увеличением термостабильности, снижением хонформационной лабильности при рН-ипдуцированном N-B переходе и уменьшением сродства к маркерным лигандам основных связывающих центров ЧСА;
ЧСА больных с хронической печеночной недостаточностью отличается от альбумина здоровых доноров и больных с хронической почечной недостаточностью увеличением количества и времени вращательной корреляции связанной воды, аномально высоким содержанием Р-структуры в лиофилизировапных образцах белка и более выраженным снижением сродства центров связывания додецилсульфата и салицилата;
физико-химические особенности ЧСА больных с хронической печеночной недостаточностью не обусловлены комппексированмем с длипноцепочечными жирными кислотами и не устраняются при делигандировании альбумина.
Личный вклад соискателя
Экспериментальный материал получен при решающем участии автора. Выбор условий эксперимента, анализ полученных данных и интерпретация результатов проведены автором самостоятельно.
Апробация результатов диссертация
Результаты диссертационной работы были представлены на IV Международном Конгрессе Всемирной Ассоциации по Аферезу (Саппоро, Япония, 3-6 августа 1992), IX Всемирном Конгрессе по Искусственным Органам (Амстердам, Нидерланды, 5-8 июля 1993), II Международной Конференции по уремической токсичности (Гент, Бельгия, 3-6 сентября 1994), VI Европейской Конференции по Спектроскопии Биологических Молекул (Вилленью д'Эск, Франция, 3-8 сентября 1995), X Всемирном Конгрессе по Искусственным Органам (Таипей, Тайвань, 14-18 ноября 1995).
Опубликованность результатов
По теме диссертации опубликовано 7 статей и тезисы 7 докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литера туры, главы "Материалы и методы", четырех глав экспериментальных исследований заключения, выводов и списка цитируемой литературы (242 источника). Работ: изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 31 рисунок.