Введение к работе
Актуальность работы. Глобулярные белки являются одним из наиболее важных молекулярных компонентов биологических систем, играющих огромную функциональную роль в жизнедеятельности клетки. Они осуществляют такие важнейшие функции, как катализ многочисленных химических реакций, протекающих в организме, транспорт веществ, передачу и преобразование энергии и информации, и многие другие функции.
Функциональные свойства белков обусловлены их уникальными структурными особенностями. Это относится как к их химической первичной структуре, так и пространственным: вторичной, третичной и четвертичной структурам. Функционирование белков тесно связано также с присущими им динамическими свойствами и конформационными перестройками, которые позволяют считать их эволюционно приспособленными и выделенными в результате естественного отбора молекулярными машинами.
изучению физических, химических и биологических свойств белков уделялось и уделяется огромное внимание в мировой науке в течение уже многих десятков лет. Оно выделилось в большое самостоятельное направление фундаментальных и прикладных исследований, в которых структурные исследования занимают значительное место.
Структурные исследования белков осуществляются с помощью всех известных -видов спектроскопии. Однако наиболее сильным методом является рентгеноструктурный анализ, способный дать детальную информацию о структуре, основанную на точном знании координат всех атомов полипептидной цепи. Но такую информацию можно получить
толкко для кристалла белка, вырастить который очень не простая и не всегда возможная задача. Кроме того, на современном этапе исследований интересна уже не структура как таковая, а еб изменения при функционировании белков, связанные, главным образом, с их конформационной изменчивостью, ' конформационной динамикой. Такую информацию можно получить только в растворе - среде наиболее близкой к естественным условиям функционирования большинства белков.
Эта задача может решаться только современными методами 2D-HMP спектроскопии, которые позволяют получить столь же детальную информацию о структуре (на уровне отдельных атомов), как и рентге-ноструктурный анализ при любых значениях рН, температуры, ионной, силы и других параметров раствора, оставляющих белок в нативном состоянии. Нативное состояние содержит в спектре 1Н-ЯМР высокого разрешения сигналы, которые имеют положения несколько отличающиеся от определяемых химической природой за счёт дополнительных взаимодействий между протонами, участвующими в образовании вто-ричой и третичной структуры, именно благодаря им и оказывается возможным получение структурной информации. Если же спектр, в результате каких-то изменений в белке, не содержит вти сигналы, то и 2D-HMP спектроскопия оказывается бессильной установить пространственную структуру такой молекулы.
Аналогичные трудности в изучении деталей структуры методом ЯМР высокого разрешения могут возникнуть и в случае исследования крупных белков (>50ЫЗ).
Исследования белкового фолдинга, являющиеся в настоящее время одной из центральных тем, показали, что молекула белка может пребывать в стабильных промежуточных состояниях, по компактности и
по содержанию вторичной структуры мало отличающихся от нативного состояния, но не имющих многих свойств, характерных для нативной молекулы. К их числу относится и отсутствие в спектрах ЯМР высокого разрешения сигналов, ответственных за структурные взаимодействия.
Таким образом, один из самых действенных аналитических методов, в ряде важных случаев выпадает из арсенала исследовательских средств. С этим трудно смириться и поэтому возникает интересная и актуальная задача адаптации метода ЯМР высокого разрешения к такого рода исследованиям.
Для решения этой задачи имеются определЭнные предпосылки, поскольку ЯМР-параметры (в частности, времена релаксации) очень чувствительны к молекулярному движению, что позволяет изучать самые разнообразные внутримолекулярные динамические процессы - кон-формационные перестройки, подвижность отдельных групп и больших фрагментов, процессы самосборки, денатурации, связывания лигандов и др.
В данной работе предложен способ адаптации метода ЯМР высокого разрешения к исследованию белков в состояниях с нарушенной нативной структурой, основанный на известном явлении спиновой диффузии и поэтому названный методом спиновой диффузии.
Этот метод лишбн возможности следить за отдельным протоном вполне определЭнного аминокислотного остатка, но дабт возможность проследить за дальнейшей эволюцией всей молекулы или какой-то е части после потери или до приобретения ею нативных свойств. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы установить взаимные соответствия между свойствами спиновой диффузии и свойствами белков и экспериментально обосновать уни-
версальность метода спиновой диффузии. При этом решались следующие задачи:
исследование свойств спиновой диффузии в процессе тепловой денатурации ряда глобулярных белков;
исследование свойств спиновой диффузии в процессе денатурации глобулярных белков сильными денатуратами;
исследование свойств спиновой диффузии в зависимости от молекулярной массы глобулярных белков;
исследование ассоциации белков при тепловой денатурации;
исследование состояния расплавленной глобулы кислых форм кар-боангидразы и а-лвктвльбумина;
исследование холодовой денатурации апомиоглобина и р-лактгло-булина;
термодинамическое обоснование метода спиновой диффузии;
исследование возможностей метода спиновой диффузии в определении структурных особенностей белков.
Научное значение и новизна. В работе впервые : - предложен метод исследования глобулярных белков, основанный на известных явлениях: ядерном эффекте Оверхаузера и спиновой диффузии - метод спиновой диффузии, позволяющий исследовать конформа-ционыв изменения не только в нативном состоянии, но, в отличие от большинства существующих в настоящее время методов, и в состояниях, которые по спектрам ЯМР и данным других методов определяются как денатурированные;
-показана возможность метода качественно и количественно исследовать процесс ассоциации белковых молекул; определять наличие стабильных промежуточных состояний в процессе тепловой или иной денатурации; достаточно быстро определять молекулярную массу или в8
Є
изменения, связанные с модификацией белковой глобулы или при взаимодействии еб с другими молекулами; получить информацию о конфигурации глобулы;
експериментально показано, что холодовая денатурация приводит к конечному состоянию, близкому к состоянию "расплавленная глобула", в отличие от тепловой денатурации, при которой конечным является разупорядоченное состояние;
показано, что состояние "расплавленная глобула" с ростом температуры подвергается разрушению, которое происходит монотонно, без особенностей, а с ростом концентрации мочевины - по типу "вс8 или ничего".
Практическая ценность. Результаты, полученные с помощью метода спиновой диффузии, наиболее прямо и убедительно свидетельствуют о наличии ярко выраженных промежуточных состояний между уникальной нативной структурой и полностью разупорядоченной полипептидной цепью многих глобулярных белков в процессе любых типов денатурации.
Предложенный метод спиновой диффузии и полученные с его помощью результаты могут быть использованы в различных областях биохимии, молекулярной биологии и биофизики.
Публикации. Основные результаты представленной диссертации опубликованы в 21 печатной работе, включающей 17 статей в отечественных' и международных журналах.
Апробация. Материалы диссертации докладывались на: симпозиуме "йізико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках" (Пущино,1Э85); 17-ом Югославском симпозиуме по биофизике (Кумро-вец,1Э86); 19-ом Югославском симпозиуме по биофизике (Сараево -Игмант,1Э88); международном семинаре "Приложения ЯМР спектроско-
пий" (Москва,1990); ІХ-ом всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохимия подвижности" (Тбилиси,1990); рабочем совещании с участием варубежных учбных "Магнитный резонанс и динамика белков" (Казань, 1991); Советско-Германском симпозиуме "Protein - nucleic acid Interaction: structural and pharmacological aspects" ( Ленинград, 1991); VII-ой конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991).
Структура диссертации, диссертация состоит из введения, где
сформулирована научная проблема и перечислены основные задачи ис
следования; семи глав, включающих експериментальний материал и
его обсуждение; выводов и списка цитируемой литературы из 171 на
именований, диссертация содержит 185 страниц, включая 163 страниц
машинописного текста, 93 рисунка и I таблицу. ^,