Введение к работе
Актуальность темы» Изучение механизма действия биологических систем на субклеточном уровне невозможно без исследования их строения. Выявление активних центров и функциональных групп, определение расстояний мекду ними, изучение локализации этих центров относительно водной фазы или поверхности мембраны, оценка степени экранирования активных центров белковыми группами и т.п. является необходимым этапом исследования биологических систем. Например, в таких биологических системах, как фотосистема П растений, реакционные центры фотооинтезирующих бактерий, монооксигеназная система микросом, система энергетического сопряжения гидролиза АТФ и восстановления азота в нитрогеназе, важную роль играют процесом электронного переноса. Направление и скорость переноса критически зависят от расстояния между центрами переноса. Если перенос электрона происходит между белками е водной фазе, скорость переноса существенно зависит от стерических факторов активных центров. Если в процессе переноса электрона принимают участие мембранно-связанные белки, важно знать локализацию активных центров относительно поверхности мембраны. Определение геометрических параметров исследуемых объектов является решающим фактором при постулировании тех или иных механизмов действия.
Для исследования строения биологических объектов используются различные методы, отличающиеся по точности, трудоемкости, характеру измеряемых величин и области применения (электронная микроскопия, рентгеноструктурный анализ, EXAFS , ЯМР, ЭПР и т.п.). В настоящее время метод ЭПР обладает самой широкой областью применения* от макромолекул до целых клеток и организмов. Сравнительно небольшое число парамагнитных центров (ПЦ) я биологических объектах облег» чает интерпретацию спектров. Введение в биообъекты спиновых метзк и парамагнитных ионов позволяет исследовать бия* объекты, не содержащие собственные парамагнитные центры, .
Однако обычный, широко распространенней вариант метода ЭПР, основанный яа регистрации формы линии * слабых СВЧ полях, позволяет в лучшем случае определять расстояния между парамагнитными центрами не более 2-3 т, чгі мяяпста*-
точно для исследования большинства белков, тем более надмолекулярных структур. Кроме того, отсутствуют методы определения глубины погружения и стерических факторов парамагнитных центров и других геометрических параметров. Это обстоятельство существенно ограничивает возможности метода ЗІР в изучении биологических систем.
Целью работы является создание теоретических и экспериментальных основ метода исследования строения биологических систем, основанного на использовании явления спин-решето :но релаксации радикалов, и последовательное применение этого метода для исследования структурно-функциональных связей в биологических системах, играющих ваяшую роль в функционировании организмов: фотосистема П растений, реакционные центры фотосинтезирущих бактерий, монооксигеназная система макросом, ферменты нитрогеназа и миозин.
Научная новизна. Созданы теоретические и экспериментальные основи комплекса методов исследования строения био-лої'ических систем, основанных на использовании явления, спин-решеточной релаксации радикалов и достаточно простых для их осуществления на серийных радиоспектрометрах. Эти методы впервые позволяют в рамках метода ЖР определять расстояния мезду радикалами и ІЩ до 10 нм, глубину погружения радикалов в биологические матрицы до 4 нм, диаметры микрофибрилл и глобулярных белков, стерические факторы белков с парамагнитным активным центром, детектировать молекулярный кислород в мембранах.
В фотосистеме П из листьев.гороха впервые определены расстояния меаду марганец-содержащиы центром разложения воды и динаром хлорофилла P6q0 и феофитином Фф, глубины погружения Pggg , Фф и промежуточного донора z , доказано кластерное строение марганец-содеряащего центра.
' В реакционных центрах из R.rubrum впервые определены расстояния между дамером бактериохлорофилла P87q и первичным акцептором (комплексом железа о убихиноном) и глубина погружения 1*870 в изолированных реакционных центрах и в
Хроматофорах. На основе полученных и Литературных данных предложен^ схема строения реакционных центров. Предложен механизм фоторазделения зарядов в результате серии туннельных' прыжков между центрами переноса.
В молекуле миозина впервые определены расстояния между SH-группой класса Sj и центрами связывания АТФ и ионов двухвалентных металлов. На основе большой величины этих расстояний выдвинуты представления об аллостерическом характере взаимного влияния этих центров и SH-rpynn.
Впервые экспериментально определена локализация гема цитохрома Р-450 в микросомальных мембранах относительно водной и пипидной фаз. На основе полученных и литературных данных конкретизированы пути переноса электрона между компонентами монооксигеназной системы.
При исследовании нитрогеназы впервые показане, что АТФ-азный центр расположен рядом с железо-серными кластерами, что подтверждает гипотезу о принудительном протопирова-нии этих кластеров в процессе работы нитрогеназы. Показано, что сверхвосстановленное состояние нитрогеназы можно получить с помощьи сольватированных электронов, и что в качестве белковых лигандов кофактора могут выступать SH-группы, и что изломы на аррениусовских зависимостях для скорости выделения аммиака и водорода обусловлены к информационным переходом в нитрогеназе при 19С.
Практическая ценность работы. Разработанный комплекс методов существенно расширяет возможности метода ЭПР в изучении строения биологических систем на субклеточном уровне. Эти методы могут быть испопьзояанн при исследовании самого широкого круга биологических объектов, от макромппекуп до сложных надмолекулярных образований. Результати, полученное при исследовании конкретных биологических систем, способствует установление их механизма действия и могут бчть использованы при создании новых промышленных кптапизяюров таких продессор, как взотфиксация, окисление ^'ливідпролов', фотораэложеяие воды и фоторазделение зарядов.
Апробация работы. Материалы диссертации докчапчрдлись на ІУ Международном биофизическом конгрессе О'ооктч, Г97?).
XI Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Таллии, 1973), Всесоюзном симпозиуме " Биофизика и биохимия мышц" (Тбилиси, 1974), Советско-американском симпозиуме по химии и физике белка (Рига, 1976), XX Ампоровском конгрессе (Таллин» 1978), ІУ Специализировались: Амперовском коллоквиуме (Лейпциг, 1979), Симпозиуме по нитроксильным радикалам (Венгрия, 1979), Всесоюзных совещаниях "Современные методы ЯМР и ЭПР в химии твердого тела" (Черноголовка, 1979,1981), Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резонанс в б.-ологии и медицине" (Звенигород, 1977,1981,1984, Одесса, 1986), Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка, 1982), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Всесоюзной школе по магнитному резонансу (Кобулети, 1985), Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды'ЧНовосибирск, 1987), Международном симпозиуме "Химическая физика форменіативного катализа" (Таллин, 1987) , и других конференциях и симпозиумах.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 31 печатная работа.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической главы, восьми глав с изложением экспериментальных данных и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 325 названий. Диссертация включает также список принятых обозначений, формулы и обозначения используемых нитроксиль-ных радикалов и три приложения. Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста, содержит ИЗ рисунков и 33 таблицы. )rf