Спектрально-кинетические исследования прямой Pr - Pfr фототрансформации нативного фитохрома овса Крылов, Андрей Борисович

Введение к работе

Лктуадыюапъ аеиы доссерпацші. Фоторецепторный белок фитохром встречается во всех высших растениях, а также во мхах, лишайниках и водорослях. С его помощью свет контролирует ряд биохимических и физиологических процессов у высших растений: биосинтез ферментов, Сахаров, нуклеиновых кислот, пигментов, клеточное дыхание и окислительное фосфорилирование, формирование пластид и мембранной структуры хлоропластов, деление и рост клеток, прорастание семян, индукцию зацветания и др.

Фитохром растений поглощает свет в синей (380-405 нм) и красной (>600 нм) областях спектрального диапазона и существует в двух относительно стабильных формах: красной Р_г, поглощающей в основном 600-700 нм, и дальнекрасной Pfr (>700 нм). Физиологически активной формой фитохрома считается дальнекрасная форма Pf_r. Образование Pfr является стартовым событием в цепи транс-дукции, завершающейся биологическим эффектом. Полного понимания механизмов транедукции до сих пор нет.

Выяснение механизма транедукции фотохромного сигнала невозможно без детального изучения P_r-*Pfr фототрансформации фитохрома, в результате которой образуется Pf_r форма. Учитывая многочисленность и разнообразие фитохром- зависимых биохимических и физиологических ответов, высказываются также предположения о том, что фитохромная транедукцля может запускаться некоторыми из долгоживущих промежуточных продуктов Pr-*Pfr фототрансформации.

Изучение промежуточных стадий прямой P_r*Pfr фототрансформации методами низкотемпературной абсорбционной и кинетической спектроскопии привели к появлению, по крайней мере, двух принципиально различных схем, описывающих, протекание этого процесса у нативного фитохрома. Первая из них, предложенная Эйлфелдом и Рю-дигером [Eilfeld, Rudiger, 1985) и получившая развитие в их последующих работах [Eilfeld et al., 1986,.1987, 19893, предполагает протекание процесса через последовательную цепь интермедиа-тов. Вторая схема, предложенная и развиваемая Шаффнером и Брас-лавски с соавт. CRuzsicska et al., 1985; Aramendia et al., 1987; Brock et al., 1987; Schaffner et al., 1990; Scurlock et al., 1993], предполагает существование в цепи фототрансформации нескольких пулов спектральных форм и течение процесса по параллель-

- г -

ным путям между компонентами этих пулов. Однако ни одна из этих схем не получила всеобщего признания. Причина этого, по-видимому, связана с тем, что эти схемы созданы в условиях, когда ещё недостаточно были изучены интермедиаты заключительных этапов фототрансформации, время жизни которых находится в миллисекундном интервале. Более того, существуют также разногласия по количеству и последовательности превращений более ранних спектральных форм.

Связь с крупными научными программами, темами. Различные этапы этой работы выполнялись.в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований по темам: "Исследование зависимости регуляторних свойств фитохромной системы от ее физико- химической организации"- 1987-1989 гг., N госрегистрации 01870037714; "Изучение взаимосвязи молекулярной организации и функционирования фитохромной системы в растительной клетке"- 1990-1994 гг., N госрегистрации 01900027723.

Цель и задачи исследования. В связи с вышесказанным представлялось актуальным уточнение количества и спектрально- кинетических характеристик промежуточных продуктов прямой фототрансформации нативного фитохрома овса и построение на основе этих данных схемы фототрансформации. Это и стало целью данной диссертационной работы.

8 диссертационной работе решались следующие задачи:

1. Исследовать спектрально- кинетические свойства всех ин-термедиатов прямой фототрансформации фитохрома, уделив особое внимание исследованию менее изученных промежуточных продуктов на заключительных этапах;

2. Построить непротиворечивую схему прямой^-Pr*Pfr фотог-рансформации фитохрома;.

3. Осуществить компьютерное моделирование на основе схемы и спектрально- кинетических данных, . полученных в эксперименте с целью проверки предположения об взаимопереходах интермедиатов в ходе прямой фототрансформации;

4. Проанализировать ьозможные взаимосвязи между наблюдаемыми спектральными изменениями и структурными перестройками апоп-ротеина в ходе прямой P_r-*Pfr фототрансформации.

Научная новизна получении^ оезулыяаглов. В работе впервые охарактеризованы интермедиаты с милллсёкундным временем жизни

Ї705. І²700 и І³700- Уточнены спектрально- кинетические характеристики более короткоживущих промежуточных спектральных форм. Построена полная схема прямой P_r-»Pfr фототрансформации фитохрома и рассмотрены взаимопереходы интермедиатов в ходе этого процесса. Предложена возможная взаимосвязь Спектральных изменений ц структурных перестроек апобелка в ходе прямой фототрансформации фитохрома.

Праіатчесіюе вначшюохь лодучешшх результатов. Полученные результаты представляют интерес для специалистов, работающих в области биофизики и биохимии фотобиологических процессов и физиологии растений, поскольку дают исчерпывающую информацию о процессе Pr-'Pfr фототрансформаиии фитохрома и могут оказаться полезными в установлении молекулярных механизмов реализации транс-дукции фитохромных сигналов от Pf_r формы хромопротеина, проявляющихся в форме разнообразных биохимических и физиологических ответов растения. Кроме того, полученные данные могут быть использованы в курсах лекций по фотобиологии для студентов-биологов и биофизиков. Ряд результатов, полученных при выполнении диссертационной работы, вошел в монографии и обзорные статьи, посвященные фитохромной тематике.

Основные положения диссергаации, выносимые на защиту.

5. Прямая Pr*Pfr фототрансформация протекает через три промежуточные стадии, каждой из которых соответствует пул спектральных форм, которые имеют близкие спектральные свойства и могут переходить друг в друга, а именно І^оо, 1ы> lit-

6. Пул первичных фотопродуктов I^і7оо содержит 2 компонента (І697 и iboo). существующих независимо друг от друга в микросекундном временном диапазоне. Наблюдаемые спектральные изменения после распада 1*700 объясняются образованием одного интермедиата 1ы. Этот интермедиат трансформируется в продукт І705.. входящий в пул Ли. В этом пуле идентифицированы и охарактеризованы 3 интермедиата: І705.І²7оо и !³700, имеющие время жизни в миллисе-кундном временном интервале.

7. С позиции существования пулов в приведенном выше смысле построенная на основе полученных результатов и комтьютерного моделирования схема Pr^Pfr Фототрансформации является последовательной. ' ' ' .

8. Сравнительный анализ, данных по фототрансформации натив-

ного и частично деградированного фитохромов указывает на существование связи между спектральными изменениями и структурными перестройками в апопротеине.

Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал получен при решающем участии автора. Выбор условий эксперимента, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно.

Апробащя результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на XIV Международной конференции по когерентной и нелинейной, оптике (КиН0'91)(Ленинград, 1991), Первом Международном симпозиуме по веленению (Пущино, 1992) и Первом съезде, белорусского общества фотобиологов и биофизиков (БОФБ) (Минск, 1994).

Опубяиковатоспь результатов. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы (два тезиса и две статьи).

Структура и объеи диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, а также выводов. Список цити-туемой литературы включает 74 литературных источника. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста и проиллюстрирована двумя таблицами и 31 рисунком.