Содержание к диссертации
Введение
1. Иммунопреципитация. Физическая сущность явления самоорганизации 13
1.1 Взаимодействие белков. Явление иммунопреципитации 13
1.1.1 Антитела и антигены 13
1.1.2 Взаимодействие антиген-антитело как частный случай белок- белкового взаимодействия 15
1.1.2.1 Описание белок-белковых взаимодействий 16
1.1.2.2 Условие образования белок-белковых комплексов 17
1.1.2.3 Динамика образования белок-белковых комплексов 18
1.1.3 Иммунопреципитация в жидкости 19
1.1.4 Иммунопреципитация в геле. Качественные и количественные методы иммунопреципитации 24
1.1.5 Автоматизация учета результатов радиальной иммунодиффузии. Анализатор «ИМАТЕСТ 01» 29
1.1.6 Существующее представление о механизме образования имунопреципитационных узоров 30
1.2 Самоорганизация. Физическая сущность явления самоорганизации 33
1.2.1 Мнимая неуниверсальность второго закона термодинамики 33
1.2.2 Самоорганизация как антиэнтропийный процесс, протекающий в открытой системе 35
1.2.3 Два подхода к пониманию физической сущности явления самоорганизации и оценке его меры 36
1.2.3.1 Физическая сущность явления самоорганизации, согласно теории диссипативных структур И.Р. Пригожина 37
1.2.3.2 Физическая сущность явления самоорганизации, согласно концепции эволюционного катализа А.П. Руденко 39
1.2.4 Примеры использования теории диссипативных структур и теории эволюционного катализа 41
1.2.4.1 Теория прогрессивной химической эволюции, основанная на теории эволюционного катализа 41
1.2.4.2 S-теорема Ю.Л. Климонтовича 43
1.2.5 Сопоставление подходов И.Р. Пригожина и А.П. Руденко 45
1.3 Образование регулярных кольцевых структур в биологических и физико-химических системах 46
1.4 Постановка задачи 49
2. Количественная модель радиальной иммунопреципитации 51
2.1 Реакция иммунопреципитации как простая система реакция-диффузия 51
2.2 Начальные данные и граничные условия 53
2.3 Параметры модели 54
2.3.1 Коэффициенты диффузии 54
2.3.2 Константы скорости ассоциации и диссоциации иммуноглобулинов 58
2.4 Сопоставление результатов моделирования и экспериментальных данных для IgA 59
2.4.1 Пространственное распределение комплексов АГ-АТ в процессе диффузии АГ 59
2.4.2 Распределение комплексов для различных начальных концентраций АГ 52
2.4.3 Причины и механизм возникновения зоны избытка продукта иммунной реакции 62
2.4.4 Калибровочная кривая. Теоретические данные и эксперимент 55
2.4.5 Динамика распространения реакционного фронта 65
2.4.6 Продолжительность движения реакционного фронта 66
2.5 Сопоставление теоретических и экспериментальных данных для IgG и IgM 68
2.6 Основные результаты модели реакция-диффузия 74
3. Качественная модель иммунопреципитации. Самоорганизация в процессе радиальной иммунодиффузии 76
3.1 Качественная модель иммунопреципитации 76
3.1.1 Продукт иммунной реакции - молекулярные кластеры 76
3.1.2 Фрактальные кластеры и модели их роста 77
3.1.3 Выбор модели роста кластеров для описания процесса иммунодиффузии 80
3.1.4 DLA-модель процесса радиальной иммунодиффузии 81
3.1.5 Программная реализация задачи 84
3.1.6 Результаты моделирования 85
3.1.6.1 Пространственное распределение крупных кластеров 85
3.1.6.2 "Калибровочная кривая" 87
3.1.7 Механизм образования крупных кластеров в процессе радиальной иммунодиффузии 92
3.1.8 DLА-модель двойной иммунодиффузии 93
3.1.9 Обсуждение результатов 94
3.2 Возможности модели реакция-диффузия. Имитация реальной фотографии чашки Петри 96
3.2.1 Математическая основа алгоритма построения модельных фотографий 96
3.2.2 Программная реализация алгоритма 97
3.2.3 Обсуждение результатов 98
2.3.1 Иммунодиффузия при повышенной температуре 101
3.3 Процесс иммунопреципитации как пример процесса самоорганизации 104
3.3.1 Иммунопреципитация - самоорганизация или организация? 104
3.3.2 Оценка степени упорядоченности пространственного распределения продуктов реакции 105
3.4 Основные результаты главы 3 108
4. Анализатор иммуноактивных молекул «ИМАТЕСТ 01» 110
4.1 Назначение и области использования анализатора «ИМАТЕСТ 01» 110
4.2 Функциональная схема анализатора «ИМАТЕСТ 01» 112
4.3 Программное обеспечение анализатора «ИМАТЕСТ 01» 112
4.3.1 Алгоритм обработки изображения 115
4.3.2 Определение концентрации иммуноглобулинов 117
4.4 Идентификация преципитационных колец 117
4.4.1 Алгоритм обработки изображения макета анализатора «ИМАТЕСТ» и его недостатки 117
4.4.2 Новый алгоритм распознавания Immune 122
4.4.3 Результаты 126
Заключение 127
- Самоорганизация. Физическая сущность явления самоорганизации
- Начальные данные и граничные условия
- Возможности модели реакция-диффузия. Имитация реальной фотографии чашки Петри
- Функциональная схема анализатора «ИМАТЕСТ 01»
Введение к работе
В физике, химии и биологии известно множество примеров самопроизвольного образования различных макроскопических структур в открытых неравновесных системах. Согласно терминологии, введенной И.Р. Пригожиным, такие структуры называются диссипативными, а процессы образования этих структур - процессами самоорганизации.
В иммунологии хорошо известна реакция иммунопреципитации — образование в тонком слое геля узоров, в результате диффузии и взаимодействия иммуноактивных белков. Особый интерес представляет собой радиальная иммунопреципитация - диффузия одного белка из точечного источника в среде, содержащей другой белок. В результате такого процесса образуется правильное, четко очерченное кольцо, размер которого пропорционален количеству иммуноактивного белка в источнике. Эта закономерность лежит в основе единственного количественного иммунопреципитационного метода - метода радиальной иммунодиффузии. В настоящее время клиническая иммунология располагает целым арсеналом средств и методов качественного и количественного анализа иммуноактивных белков: агглютинация, иммунопреципитация в геле, нефелометрия, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, радиоиммуноанализ и т.д. Среди всех количественных методов, используемых для определения достаточно больших количеств белка, выгодно выделяется метод радиальной иммунодиффузии. Он достаточно прост, воспроизводим, легко доступен практически всем лабораториям клинической иммунологии и может использоваться при массовых обследованиях.
К иммунологическим методам, помимо их высокой информативности, предъявляется такое важное требование как стандартизованность. Использование при проведении массовых обследований готовых диагностикумов отчасти позволяет стандартизовать результаты, полученные в различных лабораториях. Однако, имеющиеся на сегодняшний день методы учета результатов реакции - измерение размеров колец преципитации при
помощи специальных линеек и бинокулярной лупы не стандартизуется из-за того, что воспринимающим элементом является человеческий глаз. Появление прибора автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии позволит не только сократить трудозатраты, но и повысит точность измерения, что, в конечном итоге, позволит стандартизовать результаты, получаемые в различных лабораториях. Для решения задачи автоматизации в Институте аналитического приборостроения РАН ранее был разработан анализатор «ИМАТЕСТ» и программное обеспечение, для управления анализатором и обработки результатов с помощью компьютера. Однако результат предварительных испытаний этого комплекса оказался неудовлетворительным.
Определение возможностей совершенствования комплекса требовало хотя бы качественных физических представлений об исследуемом объекте. Кроме того, разработка количественной модели радиальной иммунопреципитации может оказать существенную помощь в решении задачи оптимизации существующих методик работы с готовыми стандартизованными диагностикумами. Между тем, в литературе полностью отсутствуют какие-либо количественные оценки по иммунодиффузии, а качественное представление, основанное на образовании иммунопреципитационного осадка в жидкости, не выдерживает никакой критики.
Следует отметить, что образование иммунопреципитационных структур происходит в открытой системе, а потому представляется возможным использовать современные физические представления из области синергетики и физики открытых систем при исследовании этого процесса. Рассматриваемая система содержит целый ряд параметров — температура среды, концентрации взаимодействующих белков, соответствующие константы скорости ассоциации и диссоциации, а также коэффициенты диффузии отдельных белков и продуктов реакции. Между тем следует ожидать, что присущее открытым системам формирование структуры обусловливается лишь одним из параметров. Представляется интересным также вопрос об упорядоченности образовавшихся структур.
Таким образом, исследование образования иммунопреципитационных колец представляется интересным не только как основа для решения различных прикладных задач, но и как самостоятельное теоретическое исследование.
Цель работы.
Основная цель настоящей работы состояла в теоретическом исследовании образования иммунопреципитационных структур в гелевой среде. Практическая цель состояла в исследовании возможностей оптимизации метода радиальной иммунодиффузии и усовершенствования комплекса автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести анализ литературных данных по диффузии белков в гелевых средах.
Разработать количественную модель иммунопреципитации в рамках представления иммунной реакции как простой бимолекулярной реакции. Оценить оптимальное время учета результатов радиальной иммунодиффузии при количественном анализе иммуноглобулинов.
Построить качественную модель иммунопреципитации, дающую адекватное представление о причинах визуальной регистрации результата иммунной реакции в гелевой среде.
Определить специфику пространственной самоорганизации продуктов иммунной реакции при радиальной иммунодиффузии.
Проверить выбор схемы освещения иммунопреципитационных колец, а также выработать практические рекомендации по совершенствованию комплекса автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии.
Научная новизна.
1. Впервые иммунная реакция in vitro рассмотрена как объект физики
открытых систем.
Впервые предложены качественная и количественная модели иммунопреципитации в гелевой среде.
Показано, что значение константы скорости ассоциации белков определяет степень упорядоченности структуры, образуемой продуктами иммунной реакции.
Практическая ценность.
Обосновано техническое решение выбора освещения иммунопреципитационных узоров для получения наиболее качественных фотографий.
Создан новый алгоритм обработки изображений для программного обеспечения анализатора «ИМАТЕСТ 01», расширяющий возможности анализатора.
Обоснована возможность сокращения времени количественного анализа иммуноглобулинов в методе радиальной иммунодиффузии.
Предложенная в диссертационной работе количественная модель может быть использована для определения возможностей оптимизации метода радиальной иммунодиффузии при работе с другими иммуноактивными белками, а также других методов иммунопреципитации в геле.
Разработанные модели могут служить теоретической основой при моделировании других иммунологических реакций или процессов с участием подобных молекул, например, при исследовании иммуносуспензионных методов диагностики и разработке соответствующей приборной базы.
Положения, выносимые на защиту.
Количественная модель радиальной иммунопреципитации, позволяющая на макроуровне объяснить образование радиально-симметричной структуры продуктами иммунной реакции.
Качественная модель иммунопреципитации, показывающая образование крупных молекулярных кластеров, которые обусловливают возможность визуальной регистрации результатов иммунной реакции в гелевой среде.
Специфика пространственной самоорганизации продуктов иммунной реакции в геле при радиальной иммунодиффузии обусловливается свойствами взаимодействующих белков и среды.
Возможность сокращения времени учета результатов радиальной иммунодиффузии при проведении количественного анализа иммуноглобулинов.
Апробация результатов работы.
Основные результаты работы докладывались на семинарах ИАнП РАН, 6-ой и 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002, 2003), 10 Всероссийской конференции студентов-физиков и молодых ученых России (Москва, 2004), 3-ем съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004).
Работа проводилась в рамках НИР "Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диагностических методов исследования", выполняемой по межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» (№ Гос. регистрации 01.200.2 09213).
Работа также поддержана грантом Санкт-Петербургского Конкурсного центра фундаментального Естествознания (грант М05-2.4К-215).
Публикации.
Основное содержание работы отражено в 5 научных публикациях, а также в сборниках трудов конференций.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 6 таблиц и 56 рисунков.
Краткое содержание работы
Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы, кратко представлены содержание диссертации, сведения о ее апробации и основных публикациях, приведены положения, выносимые на защиту.
В первой главе обобщены литературные данные по белок-белковым взаимодействиям, являющиеся основой развиваемого в гл. 2 и 3 теоретического описания иммунопреципитации, и современных подходах к исследованию процессов самоорганизации.
В первой части главы приведена краткая информация об антителах (иммуноглобулинах) - их пространственной структуре и физических свойствах, рассматриваются современные представления о белок-белковых взаимодействиях, реакции иммунопреципитации. Обосновывается несостоятельность существующего качественного представления о механизме образования иммунопреципитационных структур.
Во второй части главы рассмотрены существующие подходы к исследованию процессов самоорганизации - теория диссипативных структур И.Р. Пригожина и теория эволюционного катализа А.П. Руденко.
В третьей части главы, представлен аналитический обзор моделей различных биологических и физико-химических систем, пространственная самоорганизация которых проявляется в образовании регулярных кольцевых структур. Показано, что ни одна из рассмотренных моделей не может дать адекватных физических представлений о формировании иммунопреципитационных узоров.
В заключение первой главы формулируются цели и задачи исследования.
Во второй главе представлена количественная модель радиальной иммунопреципитации в агаровом геле, теоретическую основу которой составляет система уравнений вида реакция-диффузия. Оценено значение коэффициента диффузии белков в геле. Численные эксперименты с помощью предложенной модели позволили выявить причину и механизм образования правильной кольцеобразной структуры при радиальной иммунодиффузии. На
макроуровне иммунопреципитационныи узор представляет собой область максимальной концентрации продукта иммунной реакции. Проведено сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными, подтверждающее адекватность данной модели. Показано, что в процессе формирования иммунопреципитационного узора можно выделить две стадии: распространение реакционного фронта и формирование области избытка продукта реакции. Определена продолжительность первой стадии, определяющей минимальное время учета результатов радиальной иммунодиффузии, для основных типов иммуноглобулинов. На основании этих оценок показана возможность значительного сокращения времени учета результатов.
В третьей главе предлагается качественная модель иммунопреципитации, объясняющая причины визуальной регистрации иммунопреципитационных структур, представлен алгоритм имитации реальных результатов иммунодиффузии, а также выявляется параметр, ответственный за формирование иммунопреципитационных узоров.
Количественная модель иммунопреципитации не объясняет физический отклик на воздействие на систему узоров рассеянным диффузионным светом, отражение которого и является наблюдаемым сигналом. Единственная возможность изменить оптические свойства среды появится в случае образования не отдельных белковых комплексов, а больших кластеров, соизмеримых с длиной волны видимого света, которые могут вызвать дополнительное локальное светорассеяние среды.
Качественная модель иммунопреципитации построена по аналогии с имитационными моделями ограниченной диффузией агрегации фрактальных кластеров. Проведена проверка адекватности модели для различных масштабов задачи. Кроме того, модификация данной модели позволила исследовать процесс образования иммунопреципитата при встречной диффузии иммуноактивных белков.
Во второй части главы рассматривается алгоритм имитации фотографии результатов радиальной иммунодиффузии, получаемой с помощью прибора
«ИМАТЕСТ». В основе предложенного алгоритма лежала система уравнений количественной модели, дополненная слагаемым, описывающим образование кластеров. Пространственное распределение таких кластеров определяет интенсивность светорассеяния, используемое для построения модельных фотографий.
Далее исследуется вопрос о скорости образования преципитационных колец при различных температурах, с целью изучения возможности экспресс-постановки метода радиальной иммунодиффузии (РИД) в результате теплового воздействия, а также проверки алгоритма имитации результатов в этих условиях. Сопоставляются реальные фотографии, отражающие динамику образования иммунопреципитационного кольца, и соответствующие модельные изображения. Показывается высокая степень соответствия этих изображений.
В заключительной, третьей части главы, образование иммунопреципитата рассматривается с позиций теории диссипативных структур И.Р. Пригожина и теории эволюционного катализа А.П. Руденко, представленных в первой главе. На основе представлений теории диссипативных структур и результатов модели реакция-диффузия определяется управляющий параметр процесса иммунодиффузии и комплекс условий, обусловливающих специфику рассматриваемого процесса самоорганизации.
В четвертой главе рассматривается прибор автоматизированного учета результатов радиальной иммунопреципитации — «ИМАТЕСТ». Приводится функциональная схема аппаратной части анализатора, описывается назначение и функции программного обеспечения анализатора, области возможного использования прибора. Анализируются недостатки работы алгоритма обработки фотографий чашек Петри, использованном в программном обеспечении макета анализатора. Рассматривается новый алгоритм обработки, разработанный с учетом особенностей анализируемых изображений.
В заключении подводятся итоги работы, перечисляются основные результаты, на основании которых формулируются выводы.
Самоорганизация. Физическая сущность явления самоорганизации
Возникновение Физики открытых систем и связанной с ней теории самоорганизации, было подготовлено трудами многих выдающихся исследователей девятнадцатого столетия. Вывод Р. Клаузиуса и В. Томпсона о неизбежности тепловой смерти Вселенной при постулировании второго закона термодинамики, как универсального закона природы, никого не оставил равнодушным. С одной стороны, если признать энтропийный принцип осуществления всех самопроизвольных процессов природы за единственный, то с таким выводом нужно просто смириться, оставаясь на позициях классической науки. С другой стороны, такой вывод делает представление о мире каким-то однобоким, скучным, оторванным от «радостей действительной жизни», которые он явно игнорирует. Неудовлетворенность энтропийным принципом, в связи с его явными противоречиями с явлениями жизни, среди ученых существовала всегда. О существовании физического закона, противоположного второму закону термодинамики, говорили Г. Гельмгольц, С.А. Подолинский, Н.А. Умов, К.А. Тимирязев, К.Э. Циолковский, М. Планк, Дж. Льюис, Э. Шредингер [50], И.И. Гвай [51]. О неприменимости второго начала к биологии высказывались В.И. Вернадский [52], Дж. Бернал [53], А.А. Гухман [54], В. Байер [55], К.С. Тринчер [56]. Все чаще находились примеры явлений, противоречащих с энтропийному принципу осуществления процессов. Не говоря уже о жизни и связанных с нею явлениях, в природе обнаруживались более простые, чем жизнь, процессы, которые с точки зрения всеобщности энтропийного принципа, выглядели «странными» и парадоксальными. Это явление различных флуктуации и факты действительного осуществления многих обратимых процессов, процессы самоорганизации и саморазвития неравновесных открытых систем с «антиэнтропийным» характером протекания. Дискуссия о всеобщности или ограниченности действия второго закона и его применимости к живым организмам, особенно активно проводившаяся в середине XX века [57—65] ничего определенного не дала и оставила главный вопрос открытым. Ибо в этой дискуссии под прессом наиболее распространенного мнения о всеобщности второго закона подбирались доказательства о его применимости и ко всему живому на основе рассмотрения сложного явления: живой организм — окружающая среда в целом с оценкой конечного результата взаимодействия.
Естественно, при таком рассмотрении явления жизни будет заведомое подчинение и первому и второму закону термодинамики, так как рассматривается общий баланс обмена веществ и энергии с макроскопической средой [66]. Поэтому все полученные при таком рассмотрении «доказательства» о применимости второго начала термодинамики к жизни, в лучшем случае, могут рассматриваться сознательным или неосознанным до конца уходом от решения поставленного вопроса. Речь же должна идти о том, что энтропийный принцип, т.е. второй закон, не противоречащий явлению жизни при оценке ее энергетического баланса с окружающей макросредой в целом, противоречит специфике явления жизни и других более простых динамических явлений, имеющих в ходе их существования в самостоятельном виде антиэнтропийную направленность. Именно это и являлось предметом неудовлетворенности многих выдающихся ученых. 1.2.2 Самоорганизация как антиэнтропийный процесс, протекающий в открытой системе Осмысление противоречий между вторым законом термодинамики и явлениями жизни, а также некоторыми более простыми «странными» явлениями, свидетельствующими о действительном существовании обратимости процессов, привело к открытию явления самоорганизации, главной особенностью которого отмечалась его антиэнтропийная направленность. Работы в области проявлений процессов самоорганизации в физике, химии, биологии, в науках о Земле и космосе, в науках о человеке и его взаимодействии с природой показали повсеместное распространение самоорганизации на всех уровнях развития материи [42,43,67—73]. Наиболее убедительными проявлениями антиэнтропийных процессов на физическом и химическом уровне, исследованными не только экспериментально, но и получившими теоретическое обоснование, было открытие самоорганизации макросистем в виде диссипативных структур И.Р. Пригожиным [47,74,75], открытие концентрационных автоволн в периодических реакциях Б.Л. Белоусовым [76] и A.M. Жаботинским [77-78] и открытие саморазвития элементарных открытых каталитических систем А.П. Руденко [79-81]. Поэтому, несмотря на то, что в истоках науки о самоорганизации лежат многие важные исследования в области термодинамики необратимых процессов и рассмотрение проблем универсальности второго закона (например, работы Д. Онзагера [82], разработавшего линейную неравновесную термодинамику и установившего принцип микрообратимости, работы A.M. Тюринга [83], разработавшего теорию «химического поведения» тримолекулярных реакций и теорию антиэнтропийного морфогенеза для нестационарных нелинейных систем и др.), начало науки о самоорганизации надо связывать именно с обобщающими работами и концепциями, касающимися непосредственных оценок физической сущности явления самоорганизации как антиэнтропийного процесса. В полной мере это сделано лишь в работах школы И.Р. Пригожина и в концепции эволюционного катализа А.П. Руденко. Процессы самоорганизации, как уже было отмечено, протекают в открытых системах - системах, которые могут обмениваться веществом и энергией с окружающей средой. В любой открытой системе, в которой происходит обмен веществ и энергии Е с окружающей средой, осуществляется трансформация этой энергии на поток, затрачиваемый на внутреннюю полезную работу (9, и поток бесполезно рассеиваемой энергии Q. В соответствии с первым законом термодинамики эти потоки связаны соотношением: E=&+Q (1.2.1) 1.2.3 Два подхода к пониманию физической сущности явления самоорганизации и оценке его меры В настоящее время существуют два наиболее теоретически разработанные подхода в оценке физической сущности явления самоорганизации в открытых системах.
Это подход И.Р. Пригожина [47,74,75] и подход с позиций эволюционного катализа [79-81,84]. Оба этих подхода одинаковы в оценке антиэнтропийной природы процесса самоорганизации, но различаются в понимании причин и движущих сил самоорганизации. Эти подходы можно считать альтернативными. Альтернативность этих подходов начинается с выбора разных характеристик открытой системы для описания ее самоорганизации и оценки ее меры. В первом подходе это поток диссипации Q в уравнении (1.2.1), во втором— поток внутренней полезной работы против равновесия 0 в уравнении (1.2.1). Соответственно этому, мерой самоорганизации в первом подходе является диссипация и ее функции, а во втором — внутренняя полезная работа и ее функции. 1.2.3.1 Физическая сущность явления самоорганизации, согласно теории диссипативных структур И.Р. Пригожина Главным условием самоорганизации, согласно подходу И.Р. Пригожина, принимаются неравновесность и необратимость, причиной считается диссипация, а движущей силой— отрицательная энтропия, поглощаемая открытой системой из окружающей среды при обмене веществ и энергией. Происхождение самоорганизации связывается с потоком Q (1.2.1), который при переходе к энтропийному выражению понимается как производство энтропии Р: Q- Q/T=S; dS/dt=P (1.2.2) при этом строится термодинамика необратимых процессов [85], согласно которой: dS=deS+diS, (1.2.3) где dS — изменение энтропии системы за время dt; deS — поток энтропии, обусловленный обменом веществ и энергии с внешней средой; djS — производство энтропии внутри системы за счет необратимых процессов. В стационарном состоянии системы dS=0; deS=-diS 0 (1.2.4) а при самоорганизации (образовании диссипативных структур) dS 0; deS d,S 0, (1.2.5) т. е. необходим приток «отрицательной энтропии» (deS) из внешней среды, перекрывающий производство энтропии внутри системы. Так как, согласно этому подходу, самоорганизация открытой системы проявляется в образовании диссипативных структур.
Начальные данные и граничные условия
Исследование процесса образования преципитационных колец проводилось для иммуноглобулинов A, G и М. Поскольку каждый ИГ имеет свои особенности, сопоставление экспериментальных и теоретических данных будет выполнено для каждого ИГ в отдельности. Экспериментальные данные были получены с помощью стандартизованных сывороток ФГУП "НПО "Микроген ИмБио" и сертифицированных диагностикумов Института иммунологии МЗ РФ для определения концентрации иммуноглобулинов A, G и М. Отметим, что практически все доступные литературные данные относятся к IgG, который иногда называют "аналитическим антителом в иммунохимии". Это обусловливается относительной простотой получения, высокой стабильностью этих иммуноглобулинов в достаточно широком диапазоне температур и рН раствора, а также рядом других свойств. 2.3.1 Коэффициенты диффузии Особенности диффузии белков в пористых и гелевых средах исследованы достаточно плохо. Тем не менее, в доступной литературе можно найти ряд теоретических и экспериментальных работ, посвященных этому вопросу, среди которых следует отметить работы [116-119].
Прежде чем переходить к оценке коэффициентов диффузии в геле, необходимо определить значение коэффициентов диффузии соответствующих белков в воде. а) В воде Коэффициент диффузии IgG (молекулярная масса 150 кДа) в воде при температуре 20 С при бесконечно малой концентрации молекул IgG, согласно [120,121], Z),gG = 4 Ю-7 см с" = 0.144 мм ч". Принимая во внимание равенство масс и структурное сходство IgA и IgG (п. 1.1) будем считать, что значение коэффициента диффузии IgA совпадает со значением коэффициента диффузии IgG: DIgA = 4 10-7 см2с",=0.144 мм2 чЛ Для нахождения коэффициента диффузии IgM воспользуемся следующим выражением [120]: D = AIMV\ (2.4) где постоянная А = 2.85х10"5 см г моль 173, М - молекулярная масса IgM (950 кДа). Отсюда находим: IgM = 2.15x10-7 см2с_1= 0.077 мм2 ч"1. б) В агаровом геле Практически в каждом пособии по клинической иммунологии можно встретить информацию о том, что 1.5% агаровый гель не препятствует свободной диффузии молекул иммуноглобулинов, поскольку размер пор геля превышает размеры молекул. Однако это не соответствует действительности. Несмотря на то, что средний размер пор заметно превосходит размеры белковой молекулы, уменьшение коэффициента диффузии оказывается достаточно значительным [116]. Так, например для 2% агарового геля коэффициент диффузии молекулы с гидродинамическим радиусом 50 нм уменьшается в 5 раз (рис. 2.4). Две основные модели, используемые для определения коэффициентов диффузии макромолекул в геле предложены в работах [117,118], а в последующих работах [116,119] представлена обобщающая модель.
Воспользуемся результатами этих работ для оценки коэффициента диффузии иммуноглобулинов A, G и М в агаровом геле. Проведем оценку усредненных параметров пор геля. Согласно [122], радиус цилиндрических пор агарового геля можно оценить по следующей формуле: Гр = agarose (2.8) где Cagarose — концентрация агара. Так, для 1.5% агарового геля [116] средний радиус пор составляет 83нм. При этом, высота поры, по разным оценкам [116], колеблется в пределах 130-170нм. Таким образом, несмотря на то, что размеры пор оказываются много больше размеров молекул иммуноглобулинов (линейный размер самого большого ИГ — IgM составляет около 30 нм), вопреки литературным данным, коэффициент диффузии этих молекул в 1.5% агаровом геле оказывается заметно меньше. ф Принимая во внимание эти результаты, введем дополнительное предположение. Будем считать, что продукт реакции - комплексы АГ-АТ, размеры которых значительно превышают размеры отдельных молекул, лишены возможности диффундировать в 1.5 % агаровом геле. Вводя общее обозначение для коэффициента диффузии АГ и AT - Do, вместо (2.1) имеем: дСАЬ ІІЇ = -к САЬСАг + kdissCAg_Ab + DGArCAb, dCAg Idt = -kassCAbCAg+kdissCAg_Ab+DGArCAg, (29) Ag-Ab1vt = кШ5САЬСАё —kdissCAg_Ab. 2.3.2 Константы скорости ассоциации и диссоциации иммуноглобулинов Значения параметров k и kdjSS (константы скорости ассоциации и диссоциации комплексов АГ-АТ), как было отмечено в п. 1.1, находятся в интервале IO IO VHIO -IO V соответственно. Литературные данные щ) по этим параметрам, как и в случае данных по диффузии, относятся к IgG.
Для решения системы были выбраны следующие значения: к 180 = 106 NT c"1, kdissIgG=10"4 с"1. Как и при оценке коэффициента диффузии IgA, считалось, что порядок величин к и kdiss Для IgA такой же, как и для IgG: kasSIgA = kasSl8G =106 M- c- kdiss kdiss lO C-1. Для IgM значение k было выбрано тем же самым (kasSIgM = kasSIgG), a kdiss на порядок меньшим (kdiSSIeM =10 с"1 [1]), поскольку молекула IgM — пентамер, т.е. может связать одновременно до 10 молекул АГ, в отличие от IgA и IgG, максимальная антигенсвязывающая емкость которых составляет всего 2 молекулы АГ. Для численного решения (2.9) была использована явная разностная схема [123], программная реализация которой была выполнена на языке Visual С++ 6.0. 2.4.1 Пространственное распределение комплексов АГ-АТ в процессе диффузии АГ Решение системы уравнений (2.9) для диффузии пробы с IgA иллюстрирует рис.2.5. На этом рисунке справа показаны распределения комплексов АГ-АТ спустя некоторые интервалы времени после начала диффузии пробы с концентрацией IgA 4 мг/мл. Для визуального сопоставления результатов с экспериментальными данными на рис. 2.5 приведены фотографии одной из лунок в которую была закапана сыворотка с таким же количеством АГ. Как уже было отмечено, фотографии были сделаны с помощью прибора «ИМАТЕСТ 01». Из рис. 2.5, формирование "кольца" не носит характера распространяющейся волны возбуждения, о чём свидетельствует существующее объяснение явления иммунопреципитации (п. 1.1). Кольцеобразный узор появляется только спустя некоторое время, после чего, практически не увеличиваясь в размерах, становится всего лишь более отчётливым. Динамика пространственного образования комплексов АГ-АТ, рассчитанная по (2.9), хорошо согласуется с этими данными. Как следует из рис.2.5, спустя некоторое время после начала диффузии пробы на графике распределения продуктов реакции появляется область избытка комплексов АГАТ, находящаяся на некотором удалении от центра лунки. Избыток комплексов в этой зоне появляется только спустя достаточно длительное время, а дальнейшие изменения заключаются лишь в увеличении высоты образовавшегося пика. Таким образом, в рамках данной модели преципитационное кольцо представляется как узкая область избыточного накопления комплексов АГ-АТ, что представляется вполне естественным. Кроме того, результаты этих исследований обнаруживают две стадии процесса образования "кольца": распространение реакционного фронта и образование области избытка продуктов реакции в точке остановки фронта реакции.
Возможности модели реакция-диффузия. Имитация реальной фотографии чашки Петри
В систему (2.9) было добавлено уравнение, описывающее изменение коэффициента отражения падающего света, вызываемого образованием в геле крупных молекулярных кластеров. Поскольку точное описание изменения размера и месторасположения крупных кластеров не представляется возможным, были введены упрощающие предположения. Считалось, что зависимость коэффициента отражения падающего света Rref!C(r,t), прямо пропорциональна концентрации крупных кластеров С duster (r,t): Rrejic(r,t) С cluster (r,t), которая, в свою очередь, прямо пропорциональна: - концентрации комплексов АГ-АТ Ссот0",0 , - концентрации свободных молекул АГ в этой точке Слё(/",0; - концентрации свободных молекул AT в этой точке CAh(r,t): - Cluster ir,t) CCom(r,t) CAg(r,t) CAb(r,t). (3.3) Таким образом, искомая величина Rreflc(i",t) связана пространственными распределениями реагентов и продуктов реакции, определяемыми по (2.9), так: Rreflc(r,t) = Р Ccom(r,0 CAg(r,/) САЬ(Г,0, (3.4) где Р — коэффициент, учитывающий размерность. 3.2.2 Программная реализация алгоритма Алгоритм имитации фотографии, построенный на основе расчетов (3.4), проиллюстрирован на рис. 2.3.1. В исходном состоянии — до начала диффузии пробы, область вокруг лунки имеет однородную серую окраску ИНТеНСИВНОСТЬЮ Itotal (г) = Igrcj, ГДЄ Igrd=COnSt. В модели цвета RGB серый цвет получается путём задания одинаковой интенсивности всех трёх компонент - красной(Ы), зеленой (G) и синей (В): IR = IG h = Igrd (0 Igrd 255). Величину Igrd будем называть интенсивностью фона.
Путём визуального сопоставления было выяснено, что значение Igrcj, дающее наилучшее визуальное соответствие фотографий составляет Igrd=147. Образование в геле крупных молекулярных агрегатов в пространственной точке г и момент времени / сопровождается увеличением интенсивности отраженного света, т.е. I total (Г, t) = Igrd + Idustfr, t) , (3.5) ГДЄ IClust(r,t) Rreflc(r,t), Т.е. IClust(r,t) = У CCom(r,t) CAg(r,t) CAb(r,t). (3.6) Программная реализация рассмотренного алгоритма также осуществлялась с помощью языка Visual C++ 6.0. Для каждого момента времени t программа рассчитывала пространственное распределение реагентов и продуктов реакции по (2.9), определяла добавку IciustO") по (3.6), и создавала на экране компьютера фотографию лунки в соответствии с рис. 3.13(6). Значение параметра у также определялось исходя из условия наилучшего визуального соответствия реальной и имитируемой фотографии преципитационного кольца. На рис. 2.3.2 представлена динамика образования кольца при анализе IgA (Концентрация IgA в пробе - 4 мг/мл). Справа размещены фотографии, полученные на анализаторе «ИМАТЕСТ 01», слева - созданные на экране компьютера по предложенному алгоритму. На рис. 2.3.3 сопоставляются фотографии калибровочного ряда (0.5, 1, 2 и 4мг/мл IgA). Как видно из рис.2.3.2 и 2.3.3, визуальное сходство реальных фотографий и модельных достаточно сильное. Модельные фотографии результатов иммунопреципитации были обработаны программным обеспечением анализатора, в результате чего была подтверждена возможность эффективной работы этого алгоритма. Известно, что скорость диффузионных процессов заметно повышается с увеличением температуры среды. Попробуем сопоставить результаты иммунодиффузии в случае выдержки чашек Петри в термостате при двух различных температурах (19 и 37 С), а также проверим алгоритм имитации фотографий. Значение коэффициента диффузии при 37 С определим по классической формуле Стокса-Эйнштейна [134]: кТ О где к - постоянная Больцмана, Т - температура в К, т\ - вязкость среды и Rg - гидродинамический радиус молекулы. При Т=35 С (308.2 К) значение 7 0 1 коэффициента диффузии IgA оказывается равным DQ =4.22 10 см с , что всего лишь на 5% больше значения этого параметра при 20 С (Do = 4.0 10"7 см2 с"1).
Таким образом ускорение процесса диффузии иммуноглобулинов, при повышении температуры почти в два раза оказывается крайне незначительным. Между тем, параметры kass и клт изменяются весьма существенно. В работе [134] определяются значения этих параметров для некоторых систем АГ-АТ при Т=18 и 37 С, и показывается, что kass возрастает примерно в 2-2.5 раза, а kdiss в 3-4 раза. Будем считать, что в нашем случае kass увеличилась в 2 раза, а kdiss в 3.5 раза. Динамика образования преципитационных колец IgA при 19 и 37С показана на рис. 2.3.4. Фрагменты реальной фотографии чашки Петри (а,б) выполнены через 7, 10, 13 и 24ч после постановки реакции, модельные фотографии лунки (в,г) построены для тех же моментов времени. Сопоставление фотографий чашек Петри, выдержанных при 19 и 37 С, свидетельствует о заметном ускорении процесса образования преципитата при повышении температуры. При этом размер кольца практически не изменяется, следовательно, погрешность определения концентрации АГ также значительно « не изменится. Следует отметить, что ускорение образования колец, в основном, вызвано значительным увеличением константы скорости ассоциации белков. Предварительные оценки показывают, что выдержка чашек Петри при повышенной температуре дает возможность считывать результаты иммунодиффузии уже через 9-11 часов. При этом, алгоритм имитации фотографий, позволяет не только визуально представить результат диффузии, но и проверить возможность его обработки программным обеспечением анализатора «ИМАТЕСТ».
Функциональная схема анализатора «ИМАТЕСТ 01»
Программное обеспечение Immune осуществляет управление аппаратной частью анализатора, а также выполняет следующие функции: обеспечивает диалог пользователя с программой; выполняет ввод и обработку электронных фотографий с целью получения численных характеристик анализа; предоставляет возможность распечатать соответствующие результаты; выполняет хранение измеренной информации в виде файлов; осуществляет работу с архивом файлов, содержащих соответствующие данные. Оператор включает анализатор, запускает программу Immune, производит ввод необходимой информации об объекте исследования (рис.4.4), устанавливает чашку Петри в выдвижную каретку анализатора и производит фотографирование чашки, путём выполнения необходимых команд. Фотография чашки Петри в черно-белом формате, размера 512X512 точек, через последовательный или параллельный порт передается в компьютер и отображается на экране монитора для промежуточного визуального контроля (рис. 4.5). После нажатия оператором кнопки "Save" фотография поступает на обработку. Алгоритм обработки фотографий выполняет следующие функции: - осуществляет поиск лунок - наиболее темные области на фотографии (рис.4.6), и определяет центры лунок - для каждой лунки строит график радиального распределения интенсивности отраженного света, усредненной по углу а (рис.4.7 и 4.8). - осуществляет поиск пиков, соответствующих преципитационным кольцам, и определяет положение этих пиков - координату Rx (рис. 4.7 и 4.8) После обработки графиков интенсивности всех лунок программа выводит на экран размеченную фотографию (рис.4.9), для контроля оператором правильности результатов идентификации колец. На этой фотографии вокруг каждой лунки нарисован заштрихованный круг, радиус которого соответствует радиусу преципитационного кольца, определенному алгоритмом обработки (рис.4.9). Определение концентрации иммуноглобулинов На основе определенных алгоритмом радиусов преципитационных колец калибровочного ряда и введенной оператором информации об анализе (рис.4.4) производится построение калибровочной кривой и определение концентрации иммуноглобулинов в неизвестных пробах.
Результаты расчетов отображаются на экране компьютера в виде таблицы (рис. 4.10) 4.4 Идентификация преципитационных колец Определение концентрации АГ в неизвестных пробах, по радиусу преципитационного кольца, представляет собой достаточно простую вычислительную задачу, тогда как идентификация колец при обработке фотографий чашек Петри оказалась достаточно сложной задачей. 4.4.1 Алгоритм обработки изображения макета анализатора «ИМАТЕСТ» и его недостатки Для макета анализатора «ИМАТЕСТ» был разработан алгоритм обработки изображения, основанный на свертке функции реального распределения интенсивности (рис. 4.8) и функции распределения интенсивности для идеального изображения (рис. 4.7). Алгоритм свертки показал эффективность комплекса в целом, однако, два серьезных недостатка этого алгоритма не позволили использовать его в дальнейшей работе, а) Блик В действительности края лунок не ровные и на каждой фотографии практически все лунки имеют на краю более или менее яркий блик (рис.4.5). В результате, на графике интенсивности отражённого света появляется довольно высокий пик, не имеющий никакого отношения к преципитационному кольцу (рис. 4.8). В ряде случаев, блик оказывается ярче приципитационного кольца вокруг лунки. Если на графике радиального распределения интенсивности пик, соответствующий такому блику, оказывался выше пика, соответствующего преципитационному кольцу, алгоритм обработки принимал блик за результат диффузии пробы (рис.4.12). Указанный недостаток был временно устранён введением параметра rmin — минимальное значение радиуса поиска преципитационного кольца (рис.4.15). Однако, вследствие ошибок определения центра лунки и, в некоторых случаях, чрезвычайно высокой яркости блика, этот параметр приходилось задавать достаточно большим, т.е. приходилось удалять из рассмотрения значительную область вокруг лунки. При обработке фотографий с результатами диффузии IgA (рис.4.5) и IgG, это не являлось серьёзной проблемой, поскольку радиус преципитационных колец этих иммуноглобулинов достаточно большой. При обработке фотографий чашек Петри с результатами диффузии этих иммуноглобулинов алгоритм идентификации колец показал достаточно неплохие результаты. Между тем, для IgM, этот недостаток оказался весьма существенным для IgM (рис. 4.11, 4.12 и 4.13), поскольку преципитационные кольца IgM в несколько раз меньше, чем у IgA и IgG. Как показала модель реакция-диффузия, это связано с тем, что концентрация IgM в исследуемых сыворотках крови в несколько раз меньше концентрации IgG и IgA. б) Гиперчувствительность Однако этот недостаток оказался не единственным. В результате более тщательных исследований результатов обработки чашек Петри этим алгоритмом обнаружился еще один его недостаток - большой процент ложных преципитационных колец. Иногда нет необходимости заполнять все лунки чашки Петри, а потому часть лунок может остаться пустой. Оказалось, что вокруг некоторых пустых лунок, алгоритм обработки обнаруживает "преципитационные кольца". Исследования графиков интенсивности показали, что эти "кольца" являются следствием небольших флуктуации, возникающих на графике радиального распределения интенсивности. Эти флуктуации могут быть вызваны как засоренностью поверхности геля или дна выдвижной каретки анализатора, так и незначительными дефектами заливки самого геля. Результат такого ложного распознавания приведен на рис.4.13. В результате обработки этой фотографии макетной программой, получается ряд ложно положительных проб (№ 15, 19), причем, этот недостаток встречается с равной долей вероятности при анализе всех трех видов иммуноглобулинов. Высокий процент ошибок, обусловленный этими факторами, не позволил использовать рассматриваемый алгоритм обработки фотографий в дальнейшей работе. Таким образом, разработанный для макета анализатора алгоритм распознавания преципитационных колец продемонстрировал работоспособность комплекса в целом, однако указанные недостатки требовали разработки нового, более совершенного алгоритма распознавания.
При участии автора алгоритм обработки фотографий был усовершенствован. 4.4.2 Новый алгоритм распознавания Immune На сегодняшний день существует много различных способов обработки сложных сигналов с целью выделения полезного сигнала. Однако, программная реализация такой обработки и последующая настройка такой программы под определенную задачу достаточно трудоемки. Использование этих процедур обработки оправдано в том случае, если полезный сигнал оказывается достаточно слабым и теряется на фоне шумов. Исследование графиков распределения интенсивности всех трех иммуноглобулинов показало, что пик, соответствующий преципитационному кольцу, как правило, достаточно высокий и хорошо заметен на фоне шумов (рис.4.8 и 4.14). В связи с этим было решено создать простой алгоритм, в основе которого лежал поиск второго высокого пика (т.к. первый соответствует блику) на графике распределения интенсивности (в диапазоне rmin-rmax). Вводился параметр - пороговое значение интенсивности ожидаемого пика, превышение которого означало, что обнаруженный пик соответствует преципитационному кольцу. В случае, если таких пиков оказывалось несколько, алгоритм выбирал наиболее высокий. Высота пика, при этом, отсчитывается от нулевого значения интенсивности. Обработка фотографий чашек Петри с результатами диффузии всех трех иммуноглобулинов продемонстрировала достаточно высокую эффективность такого алгоритма идентификации колец. Более того, оказалось, что процент ошибочной идентификации колец IgA и IgG этим алгоритмом меньше, чем при идентификации алгоритмом свертки. Однако для слабоконтрастных колец IgM (рис.4.11), которые образуются в результате диффузии этого иммуноглобулина, процент идентификации колец этим алгоритмом оказался чрезвычайно низким. Как показала модель реакция-диффузия, это обусловливается свойством данной реакции (в этом случае, количество белка, образующего преципитат значительно меньше, см. напр., рис. 2.11 и 2.12), а не техническим недостатком анализатора. Причины снижения эффективности работы алгоритма при работе с этим иммуноглобулином проиллюстрированы на рис.4.14а (для сопоставления с IgA см. рис. 4.8).