Са2+-зависимая регуляция Na+, K+-АТР-азы эритроцитов крысы Панюшкина, Елена Александровна

Введение к работе

Актуальность темы.

Одна из существенных функций биологических мембран обеспечение избирательной проницаемости для веществ, транспортируемых в процессе жизнедеятельности клетки в среду и из среды в клетку. Мембранные белки, осуществляющие транспорт Na⁺, К⁺, Са и Н⁴", сопряженный с гидролизом АТР, участвуют в неравновесном распределении ионов, внутри клетки, . изменение которого приводит к запуску целого ряда биохимических событий. Накопившиеся данные свидетельствуют о существовании быстрых и множественных механизмов регуляции АТР-зависимого транспорта Na⁺ и К⁺ с участием вторичных внутриклеточных мессенджеров.

Са -АТРаза плазматических мембран играет ведущую роль в поддержании низкой концентрации Са (ЮМ) в цитозоле. Изучение регуляции этого фермента приобрело особенно большое значение в связи с открытием регуляторной функции ионов' Са в клетках. Несмотря на многочисленные попытки изучения влияния ионов Са на регуляцию Na⁺,K⁺-Hacoca плазматических мембран, вопрос до сих пор» остается невыясненным. Результаты исследований, свидетельствующих об активации Na⁺,K⁺-ATPa3H ионами Са²⁺ в концентрации ниже I цМ, довольно неоднозначны из-за неопределенности условий проведения экспериментов. Противоречивы данные не только об активирующем действии Са , но также о регуляции активности Ыа⁺,К⁺-АТРазы эндогенными протеинкиназами; окончательно не выяснена природа и механизм действия Са -зависимых эндогенных регуляторов.

В то же время, результаты многочисленных исследований гормональной регуляции ионтранспортирующих АТР-аз на интактных клетках плохо согласуются с данными, полученными на выделенных мембранах. Эти несоответствия во многом объясняются неконтролируемым нарушением нативного комплекса эндогенных регуляторов при выделении мембран.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было выяснение участия эндогенных Са -зависимых регуляторов и прогеинкиназ в функционировании Ыа⁺,К⁺-АТРазы плазматической мембраны эритроцитов крысы.

Для этого в работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Отработать методику получения перфорированных мембран эритроцитов, исключающую длительную процедуру получения вывернутых везикул с неконтролируемой отмывкой регуляторов.

2. Оценить влияние ингибитора Иа⁺,К⁺-АТРазн уабаина на активность Са -АТРазы в присутствии эндогенных регуляторов.

3. Исследовать зависимость активности Na⁺,K⁺-ATPa3H от концентрации Са в присутствии и отсутствии эндогенных регуляторов.

4. Изучить влияние Са -зависимого эндогенного ингибитора Na⁺,K⁺-ATPa3H на чувствительность фермента к уабаину, Na⁺, К⁺ и фуросемиду.

5. Определить возможное наличие в мембранах эритроцитов Na⁺,Mg²⁺-ATPa3H и уабаин-нечувствительной фуросемид-ингибируемой Na⁺-ATPa3H.

6. Исследовать действие сАМР на Са -зависимую регуляцию Na⁺,K⁺-ATPa3H.

Научная новизна.

Показано, что при измерении активности Ыа⁺,К⁺-АТРазы как уабаин-чувствительной компоненты общей АТР-азной активности в присутствии Са²⁺ и Са²⁺-зависимых регуляторов вносится существенная ошибка, обусловленная Са -зависимым действием уабаина на Са -АТРазу. Неспецифическое влияние уабаина на Са -АТРазу свидетельствует о невозможности использования уабаина для идентификации активности Ыа⁺,К⁺-АТРазы на фоне Са²⁺-АТРазы. Показаны Са -зависимые активация и ингибирование Ыа⁺,К⁺-АТРазы, зависимость Са регуляции активности фермента от ионов М$г⁺, подавление сАМР Са -зависимой активации Na⁺,K⁺-ATPa3H.

Выявлено, что при микромолярных концентрациях Са частично теряется чувствительность Na⁺,К⁺-АТРазы к уабаину и резко падает ее сродство к К⁺.

Практическая ценность.

Результаты настоящей работы расширяют представления о механизмах регуляции функционирования ионтранспортирующих АТР-аз плазматической мембраны эритроцитов крысы. Они могут быть

использованы для выяснения этиологии целого ряда заболеваний, связанных с нарушением Са²⁺- и Ыа⁺/К⁺-обмена.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей.

Объем и структура диссертации.

диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы из 140 наименований, диссертация изложена на 91 странице машинописного текста, включая 10 рисунков и 4 таблицы.