Са2+-активируемый фотопротеин обелин из гидроидных полипов Obelia longissima Бондарь, Владимир Станиславович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Биолюминесценция многих видов морских кишечнополостных объясняется наличием в гидробионтах сиоци-фических белков, получившх название Са -активируемые фотипро-теши, которые обладают способностью генерировать кванты света при взаимодействии с ионами кальции. Фотопротешш представляют собой фермент-субстратный комплекс белка и связа>шого с ним лю-циферша, находящийся в неактивном ооотоянии. Реакция светоизлу-чения данного класса белков не требует присутствия молекулярного кислорода, каких-либо кофакторов, а также органических субстратов. Для излучения свата достаточно присутствия фотопротеина и шшцнирувдего реакцию иона. Это отличает реакцию фотопротешов от биолшянесцентннх реакций, например, бактериальной или свет-ляковой лвдифераз, в которых фермент в присутствии кислорода катализирует окисление люциферина о переводом его в возбужденное состояшіе и последующим излучением света.

В настоящее время известно до 25 видов люминесцируюших морских кисечнополостных, включающих семейства Cnidaria и Otenopho-га, обладающих фотопротешовш типом биолюминесценции. Шесть из известішх Са ⁺-активируеыых фотопротеинов выделены с применением хроматографических методов, причем только три в гомогенном виде, и охарактертзованы.

Высокая специфичность и чувствительность (до 10^-) к ионам кальция позволили использовать фотопротеины для прижизненной индикации кальция в клетках различных оукариотических организмов, а тагске в различных биологических кидкостях. Несомнешшш преимуществами фотопротешюв как индикаторов кальция являются:легкость регистрации лкмшеецентного сигнала, шрокий диапазон измерения (10 - Ю^-4 М), устойчивость к внутриклеточному окруке-нию, отсутствие токсшшости. Два из известных фотопрогогагов, ак-воріш из гидромедузы Aequorea forslralea и оболин из гидроидов Obelia geniculate, активно и весьма уснеатю используются для измерения ионов кальция.

Цель и задвчи исследования. Целью работы являлось иослодо-вшше Са -активируемого фотопротеипн обелила из лкминесцируще-

г, _

го колоішального гидроидного поліша Obelia longiBeima, одного из наиболее массовых видов, обитающих в территориальных водах России. Выполнение даіаюго исследоваїшя тробовало решения сладующіп: экспериментальных задач:

2+

\. Разработать метод выделения и очистки Са -активируемого фотопротоша обелшт из гидроидного поліша Obelia lonsioolma и па ого осново получить высокоочкценный. препарат отого белка.

2+

1. Исследовать фізико-химичеокие свойства выделэнного Са -активируемого фотопротенна обелина.

2. Проваріть возможность использования полученного препарата обелша для индикации внутриклеточного кальция.

Научная новизна и практическая цошюсть.

1. Газработаш технологии окстракцші фотопротоіша обеліша
из биомаооы гидроидных полипов Obolia longiBoima, обработки ок~
отракта для получения препарата, пригодного для хроматографичес-
кого выделения, и предложена охеме последующей очистки белка до

ГОМОГеШЮГО ОООТОЯЕИЯ.

3. Наследованы ооновныо фнзико-хшичэскно СЕойотва выделенного фотопротеина: молекулярная масса белка в нотивішх н денатурирующих условиях, спектр лхмпнесцешпга фотопротеина, удельная активность, константа поевдопорвого цорядка опада лшинесцогаиш, квантовый выход, оігашуші температуры и рН, влигашо температуры на активность и отабильнооть белка, чувотвитольиооть к ионам ш-льция, вцц&лены три различные молекулярные Jopuu обе лиш.

4. С помощью полученного фотопротеина, загруженного в макрофага мышей, изморена концентрация попов кальция внутри интакт-шх клеток, находящихся в покое и пра воздействии на них различных отшіулятороп.

Получешшо результаты позволяют одолать заключение о воз-ыошооти использования фотопротоша обелила из гидроидов Obelia lonsieoima п кччоотве индикатора ионов кальция внутри интактных клеток и биолопгчоэгак шідкостях. Ооновішш облаотяни применения боліса могут стать физиология, медвдинокая диагностика, годіуноло-пія.'

На осново технологии яыдэлешя и очноткн фотопротешіа, разработанной в дшшоп работе, налажено ыолкоееряяное производство

- * -

препарата обелина для индикации ионов кальция.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 1-ой Международной школе по биологической люминесценции (Польша, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная ензи-ыология" (Москва, 1991), Всесоюзном совещечип "Энергетичеокие аспекты клеточной физиологии" (Путино, 1988), Всесоюзном совеща-нии "Молекулярные механизмы и регуляция рнергетичеокого обмена" (Пущино, 1990), на семинарах лаборатории фотобиологии Инотитута биофизики СО АН СССР. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 2 препринта.

Структура и бгем работа. Диссертационная работа изложен» на 131 странице машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключенно, вывода и описок цитируемой литературы (123 источника, в том числе 100 иностранных).

Диссертационная работа проиллюстрирована 39 рисунками, содержит 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2+ Са -активируемый фотопротеин обелин получали из морского

биолюминесцирувдего гадроидного полипа Obelia longiBsima. Выбор используемого объекта определялся щшзде всего тем, что данный вид гидроадов является наиболее маооовны видом территориальных вод России, встречающимся преимущественно в холодных и умеренных водах (Степаньянц, 1980). Сбор гашотннх проводили в акватории Чупинской губы Кандалакшского залива Белого моря о индиевой плантации Беломорской биологической станции Зоологического института АН СССР в осенний период, поскольку в вто время года ваб-лвдаетоя наибольшая скорость роста и вегетации колоний гидроидов (Летунов, Степаньянц, 1986).

Активность обелина измеряли на биолюминометре БЛИ 8801 (ИБ35 СО АН СССР, Красноярск) в экранированной от внешнего оопещения кювете, содержащей 0,5 мл буфера (0,1 U Трио-Н01, 0,01 М ЭДТА, plf 9,8) и 0,1 ила 0,01 мл исследуемого образца. Реакцию инициировали впрыскиванием 0,2 мл Са01₂ (0,36 М CaClg в 0,1 II Трии-ШД буфере, рН 8,3). Биолшинесщштннй сигнал регистрировали при помощи самописца 2201 (LKB, Швеция).

При очистке обелина использовали стандартное хроматоі'рафи-ческое оборудование фирм "LKB" и "Pharmaoia" (Швеция).

Динамик/ процесса очистки белка контролировали с помощью SDS-електрофорезв, проводимого по методу (Laemmli, 1974). Окраску гелевых пластинок после фореза проводили AgNO,.

Содержание белка в образцах на етапах очистки измеряли метолом микроопределения бе.»ка с биуретовым реактивом (Кочетов, 1971) и по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

Молекулярную иассу нативного белка определяла гель-фильтрацией на колонке Superoee 12 HR 10/30 (FPLC). Молекулярную массу в денатурирующих условиях определяли електрофорезом в 12,536 ПААГ с добавлением 0,1 SDS. Определение молекулярной массы проводили относительно калибровочных белков.

Спектр люминесценции фотопротеина записывали на спектрофлу-ориметре Р-4000 (Hitaohi, Япония).

Зависимость интенсивности люминесценции обелина от концентрации ионов кальция исследовали с помощью кальциевых буферов. При раочете соотношения холатсров и ионов кальция, проводимом на ЭВМ "Иокра-226", за основу была взята программа, предложенная в работе (Fabiato, Pabiato, 1979).

Нагрузку перитоноальных макрофагов мышей линии C057/W обе-лином проводили методом лизиса пиносом (Okada, Raohstelner, 1S82), ыодифицировашшм для макрофагов и обелина из гидроидов Obelia genloulata (Hallett, Campbell, 1983). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение препарата обелина. Технология получения чистого фотопротеина включала два основных етапа: 1) екстракцию из гидроидов, фракционирование 10Ж поливтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной иаосой 6000 и оульфатом аммония в диапазоне 40-75% насыщения; 2) гвль-<їальтрацяю на оефадекое С-75 (fine), ионообменную хроматографию на Полиоил СА-300 (10 мкм), гидрофобную хроматографию па фенил-сефарозе CL-4B, гель-фильтрацию на софакрило S-200, ионообменную хроматографию на колонке Hono Q при pi! 7,0, хроматофокуеированиэ на колонко Копо Р, последовательные ионообменные хроматографии на коленке Mono С при рН среды 5,5, 8,0 и 7,0, соответственно.

_ 6 -

Перед началои экстракции колонии гидроидов выдерживали 2-3 часа в иорской воде при экологической температуре +4С, так как при ыехачическом воздействии во время обора гидроидов значительная часть фотопротеїша самопроизвольно высвечивалась, ионы кальция из среда удаляли помещая гидроида из морской воды в изотонический буфер (ЗОС мМ Ма01, 100 Ш ЭДТД, 10 мМ Трио~НС1, рН 7,0) на 1 шшуту. Экстракцию фотопротеина проводили перенося колонии издроидрв в гипотонический буфер (50 Ш ЭДТА, 10 мМ Трис-Н01, рН 7,0) и подвергая их механической обработке руками в течение 5-Ю шшут. При таком способе обработки из гидроидов экстрагируется более 80% активного фотопротеина. Последующее фракционирование екстракта ПЭГом и оульфатом аммония позволяет значительно отделить балластные белки и получить высокую кратность очиатки фота-протеина (Табл.1). Существенное повышение выхода обелина на етапах, следующих за экстракцией белка, вероятно, мокно объяснить тем, что в исходном препарате присутствует ингибитор (или несколько ингибиторов) люминесценции, который удаляется при обработке ПЭГом. В пользу отого предположения может свидетельствовать тот факт, что при относительно малой (в 2,5 раза) очистке по белку на этой стадии наблюдается семикратное увеличение удильной активности фотопротеїша. Полученный препарат использовали для дальнейшей хроматогрвфической очистки.

Хроматографические методы комбинировали таким образом, чтобы общий процесс очистки обелина был наиболее технологичным и позволял использовать образец после предыдущего этапа оразу ке без дополнительных подготовительных стадий. Из динамики очистки фотопротеина (Рпо.1) видно, что наиболее аффективными оказались стадия хроматотофокусирования на колонке Mono Р, при которой количество балластных белков удалось свести к минимуму, и стадия ионообменной хроматографии на колонке Mono Q при рН 8,8 поскольку после нее фотопротеин практически не содержит примесей.

Разработанная технология позволила получить в гомогенном виде (Рио.1) Са -активируемый фотопротвин обелин из гидроидов вида Obelia longieaima, основные физико-химические характориоти-га^т которого представлены в Тьбл.2.

На последней стадии очистки белка (хроматография на колонко

Таблица 1. Схема первичной очистки обелина из гидроидного полипа Cbelia lonsissima

Стация

Объем Балок СушарныЯ Активность Суммарная Удельная Выход Фактор
(мл) (ыг/ioi) белок (отн.ед./ші) активность активность С Z ) очистки
(ыг) (отн.ед.) (отн.ед./ыг)

332000 6Є40000 25349,2 277 113,2

Прииечание: В таблице представлены типичные данные очистки обелина из разового сбора гидроидов. Аналогичным образом обработана вся биомасса.

|) 3 ьч ^ „* f j* і 4 j.f^ j

,o я u» „_ """"*.

tvf **| IM* *»» —~ ~ »»*«»» Л

S| ly ' ' '"*

67 kDa

Ь 45 kDa

^>.~

( 12.5 KDa

'S3 '< 6.5 KDa

Piio.1. Элек?рсф>рогр,има бэдкошг препаратов на етапах ви-дёлепня обелила.

1-лсїодшй преварзї; 2--Sephaelos С-75 (ІЗпо); З-Полнсші СА-300; 1 -Phenyl Sepliaroao CL-4B; 5-ЕйгЛгзсгу1 S-200; б-Uono Q (pH 7,0); 7 -Поло Р (рн 6,0-4,0); O-TJono Q(p.1 5, 9-Hono Q (рП 0,3); 10-Hono Q (рН 7,0); И-цизкаюденулярішв наркорше белки. (29 kDa -карбоапгадраза; 12,5 kDa - цитохром С; 6,5 kDa - ингибитор трнп-сіша бычиП); 12-вїіеокоиалеку.яяріше маркерше бвлки (67 kDa - бычий сітороточішП альбумин; 45 kDa -яичный адьбушін; 29 kDa -карбоапгадраза) .

Таблица 2. Некоторые характеристики гомогенного обеліша

Mono Q при pH 7,0) было показано совпадение пика активности фотопротеина как минимум с тремя белковыми пиками, что послужило основанием для предположения о наличии в полученном препарате обелина нескольких молекулярных форм, как ето. например, показано дли акворина (Shlmomura, 1936) и мнемиопсина (Ward, Seliger, 1974).

Выделение изоформ обелина. Схема выделения молекулярных форм обелина включала следующие стадии: последовательные ультрафильтрации о использованием системы "Kinitan" на мембранах с пределом исключения 30 и 10 kDa, ионообменные хроматографии ыа Полиоил СА-300 (10 мкм) и колонке Mono Q, хроматофокусирование на колонке Mono Р о добавлением в елюенты детергента Тритона Х-100 (16), последовательные хроматографии на колонке Mono Q. При хроматофокусировашш удалось разделить три пика фотопротеиновой активіюоти, а последующими дополнительными хроматографияш на колонке Mono Q выделить три практически гомогенных белка (А, В и 0), обладающих фотопротеиновой активноотью (Табл.3).

Таблица 3. Свойства молекулярных форм обелина

Препарат обелина для индикбции внутриклеточного кальция и его некоторые свойотва. Препарат получали по основной схеме выделения (см- выше), используя пять хроматографических стадий. Очищенный примерно в 1000 раз с выходом 54 (Табл.4) обелин имел удельную активность 1.6 х 10 квант на 1 мг белка, что в пересчете на активность гомогенного фотопротеина соответствует 33* чистоте препарата. Некоторые свойства полученного препарата были изучены.

Оптимум рН. Для обелина из гидроидов O.longlsaima оптимум рН располагается в интервале 9,0-10,5 (Рис.2а). Молекулярные константы ионизации фотопротеина, рассчитанные из полуширины полученного графика, составили рК. 6,8 и рК^ 12,2. Константы ионизации для активного центра фотопротеина, определенные из зависимости константы псэвдолервого порядка скорости спада люминео-центноЯ ревкции от рН соотавяли рК₁ 9,1 к рК₂ 10,2. Это позволило предположить возможность влияния па каталитический акт люминесценции остатков аминокислот, ионизация которых лежит в интервале рН 9.0-10,0. В частности,- ото могут Сыть SH-группа циотеи-на, Е-аминогруппа лизина, гидрокопфонпльнал группа тирозина, а также N-концєвая аминогруппа белка. Поскольку дитиотреитол в концентрации 1,0 мМ стабилизировал активнооть обелшш, а ДТНБ (0,1j 1,0 мМ) ингибировал биолюминесценцию, то весьма вероятно предположить наличие существенно важней SH-групш (групп) в молекуле обелина, находящейся либо в активном центре, либо вблизи него.

Оптимум томпературц. Максимум лгашнеоцонции обелила наблюдается при температуро 4-150 (Рио.2б), что коррелирует с оптимумом лшинееценцип отдельного зооида (4-60), изолировшшого от колонии гидроидного полипа О.іоодіваіка (Летунов, Внсоцкий, 1988).

Термоотабильиость и тормоинактивация фотопротоина. Минутная инкубация пгч температурах до 50С практически но сказывается на активности обелина (Рио.2в). При 600.сохраняется около 40 ио-ходней активности белка. Обработка при 70С практически полностью инактгашруот фотопротеин (остоточная активность составляет но более 4). Сульфат аммония значительно повышает термостабиль-

- II -

Таблица 4.

Схеыз очистки обелина из гидроидного полипа Obelia longissima

температура, С

2f

о t-4

температура, С

-рСа

Рис. 2. Зависимость интенсивности биолюминесценции обелина от рН (а), температуры (б), продзарительного минутного инкубирования белка при разных температурах Св) и концентрации ионов кальция (г).

ь- интенсивность биолюминесценции обелина (отн. ед.); її -интенсивность биолсминесценции обелина при насыщающей концентрации кальция;Ь20С-интенсивиость биолюминесценции обелина при 20 С.

ность обелина, позволяя проводить его термообработку при более высоких температурах. При 65, 70и даже 75-80С в течение 1 мин удается сохранить до 50 активности белка при наоыщении инкубационной среды сульфатом аммония 10-20. 30-50 и 60-90. соответственно.

При температуре 20-220 фотопротеин полностью сохраняет активность в течение трех суток. При более низких температурах (около +4С) препарат сохраняет активность в растворе не менее 3 месяцев, а в лиофильно Еысушеняом виде при -1Э0 - в течение года. При 30С активность фотопротеина снижается через 1 час на 4%, при 40^СС - на 25-30. Время термоинактиваїт белка существенно сокращается при 50С и вше. На основании полученных данных были рассчитаны константы терлоинактивации обелина, которые ооставили 5,3х10^_/* мин ; 5,4х10~³ мин ; 1,5x10" шш" ; 1,04 мин ; 2,8 шш~ для температур 30, 40, 50, 60 и 70С, соответственно. Сульфат аммония существенно снижает константу инактивации фотопротеина.

Чувствительность к ионам кальция. Из графика зависимости биолюминесценции обелина от концентрации ионов кальция (Рис.2г) видно, что обелин- позволяет регистрировать концентрацию свобод-ного Са в среде от 10 U и выше. Это весьма сущеотвешю, поскольку физиологический диапазон концентрации ионов свободного кальция в различных клетках составляет от 10 Ы (в покое) до 10 М (при возбуждении) (Blinka et al., 1982). Зависимость имеет сигмоидный вид, n^ = 1,51. Величина ковффициента Хилла указывает на то, что на молекуле обелина имеется, по крайней мере, два функционально ванашх центра связывания кальция, при заполнении которых происходит запусіс биолшинесцеятной реакщш. Ионы свободного магния в.концентрации 0,3 мМ незначительно сдвигают калибровочный график, однако характер сигыоидаой кривой и угол наклона при етом практически не меняются (rL = 1,48).

Применение обелина для индикации внутриклеточного кальция. Для стимуляции макрофагов, нагруженных обелином, использовали сыворотку крупного рогатого скота (сКРС), цАМФ, NaP, АТФ.

Известно, что сыворотка оказызает стимулирующее действие на макрофаги, способствуя процессу прикрепления и распластывания

_Mwtt

_щ

35 с.р.о.
t90e.

ги%> сыв. крс

Т 50 е.р.а. —90 а.

Я! -»**

Т=»

20 мкМ цАМФ

Рис. 3. Уровень свободного цитоплазмагического кальция в макрофагах, стимулированных сывороткой крупного рогатого скота (а) и цАйї (б). I - уровень шума прибора, 2 - уровень "фонового" с печения макрофагов в покое. Стрелкой отмзчен момент добавки стимулятора.

клеток на твердой подлояске (Kruskal, Maxfleld, 1987). Этот процесс можно рассматривать как фагоцитоз "частицы бесконечного размера". При добавлении в суспензию макрофагов 2056-ной оКРС, наблюдается быстрый (5 сек от момента добавки) всплеск биолюминесценции (Рио.За) с амплитудой до 100 импульсов, что соответствует повышению внутриклеточного кальция до 1,7 мкМ, и быстрым падением до фонового свечения 20-30 шшульсов. Подобные воплески биолюминесценции о быстрым затуханием свечения с некоторой периодичностью наблюдаются в течение не менее 30 минут. Перлодичг-ность наблюдаемых сигналов может быть связана, вероятно, о тем, что прикрепление к стенкам кюветы не является <-тщоиотнтиш синхронным процессом, в силу большого (10-15.млн) количества клеток в суспензии, а носитвременной вероятностный характер.

Ионы Са и ЦАЫФ выполняют в организме функции посредников в процессах внутри- и межклеточной сигнализации, причем действие систем регуляции кизнедеятельности клетки с их участием пересекается Цлберто и др., 1987). цАМФ, добавленный к оуспензии клеток вызывает развитие быстрого (через 5-Ю сек) люминесцентного

2+

сигнала с амплитудой до 200 импульсов (концентрация Са повышается до 2,2 мкМ) <Рис.36) с падением к 30 сек до 100-80-50 иы-пульоов и последующим снижением до 20-30 импульсов. В последующие 5-Ю мин наблюдений возникновения новых сигналов нэ отмечается. ЭГТА не снимает стимулирующего еффекта цАМФ, что указывает на повышение внутриклеточного Са под действием ЦАЫФ за счет выхода кальция из внутриклеточных депо.

?+

1. Разработана технология получения в гомогенном виде Са -

активируемого фотопротеина обелина из биолюминесцирующих гидроидов вида Obella longissima. Показано, что выход гомогенного белка из 1 кг биоыасоы гидроадов составляет 62 мкг.

2. Определены основные характеристики обелина из гидроидов
Obelia longissima: молекулярная масса в натишшх условиях сос
тавляет 30 kDa, в денатурирующих - 19,8 kDa; удельноч активность

- 4,9 х 10 квант на 1 иг белка; квантовый выход - 0,16; конс-

танта псевдопервого порядка спада биолюминесценции - 4 о~ ; спектральний максимум люминесценции - 469 нм; оптимум рН бполв-мипеоценции - 9-^10,5: оптимум температуры биолюминесценции -4-15С; чувствительность к ионам Са^с+ - 10 М.

3. Показано, что фотопротеин из гидроидов Obelia longiBsim тормоотабилон в интервале температур 20-50С, а добавка сульфата штаты позволяет существенно повисить устойчивость белка к тепловой денатурации при более высоких температурах.

4. Показано, что обелин по гидроидов Obolia longissima представлен тремя молокулярнымп формами, имеющими одинаковую молекулярную массу и различающимися удельной активностью, константами псевдопервого порядка спада лшпнесценция и газантовш виходом.

5. Получен препрраг обеліша, пригодный для использования в

2+ качество индикатора ионов внутриклеточного Са , н налапоно ого

мелкосерийное производство. Препарат очищен в 1000 раз, имеет активность 1,6 х 10*' ісвант на 1 мг белка. В лиофилъно высушенном виде препарат хранится при -18С в точошіо года боз потери активности.

6. В модельних експериментах на поритонеальных макрофагах
мышей показана пригодность полученного препарата обелина для ко
личественного измерения концентрации ионизированного кальция как
внутри похоящихся клеток, так и при воэдейстшш на них различных
стимуляторов, напрмер, сыворотки крупного рогатого скота, цАВД,
АТФ, NaP.