Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. цель и задачи исследования.
1.1. Культивирование и практическое использование морских одноклеточных водорослей .11
1.2. Рост и фотосинтез морских микроводорослей в различных условиях минерального обеспечения... 16
1.3. Световая зависимость роста и фотосинтеза водорослей 26
1.4. Постановка задачи исследования 40
Глава 2. Объекты и методы исследования.
2.1. Характеристика объектов 43
2.2. Методы культивирования. .48
2.3. Измерение параметров культуры 50
2.4. Расчет показателей фотосинтеза водорослей 51
2.5. Планирование экспериментов 55
Глава 3. Экспериментальное изучение роста водорослей в различных условиях минерального обеспечения .
3.1. Потребность водорослей в азоте и фосфоре... 56
3.2. Рост водорослей в зависимости от концентрации железа в среде 70
3.3. Влияние микроэлементов на рост водорослей 75
3.4. Выводы к главе 3 88
Глава 4. Количественное описание роста и фотосинтеза клеток в зависимости от светового фактора.
4.1 Уравнение оветозависимого роста включающее фотоингибирование. 92
4.2. Зависимость содержания клеточных пигментов от световых условий 103
4.3 Экспериментальное определение коэффициентов модели...110
4.4. Выводы к главе 4 119
Глава 5. Рост и фотосинтез водорослей в культурах различной плотности.
5.1. Стационарные концентрации биомассы водорослей в плотное-татном режиме культивирования 124
5.2. Условия реализации максимальных ростовых и фотоэнергетических свойств водорослевых культур различной плотности..133
5.3. Экспериментальное изучение ростовых и фотоэнергетических показателей непрерывных плотных культур водорослей в различных условиях выращивания «142
5.4. Выводы к главе У 149
Обще выводы 150
Литература 152
- Рост и фотосинтез морских микроводорослей в различных условиях минерального обеспечения...
- Расчет показателей фотосинтеза водорослей
- Рост водорослей в зависимости от концентрации железа в среде
- Зависимость содержания клеточных пигментов от световых условий
Рост и фотосинтез морских микроводорослей в различных условиях минерального обеспечения...
Для нормальной жизнедеятельности водорослей на свету, как и любых других растений, необходимо обеспечить их потребность в элементах минерального питания - биогенных элементах. Биогенные элементы делят на две группы: элементы и их соединения, требую-щиеся растительным организмам в относительно больших количествах и называемых макроэлементами; элементы, необходшлые в малых количествах, - микроэлементы. Резкой границы между ними нет, так как потребность разных организмов в элементах различна. К основным макроэлементам относятся азот, фосфор, калий, сера,натрий и магний. Первостепенное функциональное значение для всех организмов имеют азот и фосфор (Вернадский, 1967). К микроэлементам, заведомо необходимым для растений, Эйстер ( Eyster, 1964) относит железо, марганец, медь, цинк, бор, кремний, молибден, хлор, ванадий и кобальт. Действие микроэлементов сходно с витаминами, которые часто включают, например, такой элемент, как кобальт т обязательный компонент витамина В.
Особенностью в изучении действия биогенных элементов на метаболизм морских водорослей является то, что морская вода содержит практически все компоненты, необходимые для нормальной жизнедеятельности клеток (Глебович, 1974). Однако соотношение элементов в морской воде значительно отличается от потребностей водорослей в них. В результате этого некоторые компоненты полностью извлекаются из воды клетками в процессе их роста и становятся лимитирувдими факторами, особенно в периоды массового развития фитопланктона. К таким компонентам, в первую очередь, относятся азот и фосфор. Остальные макроэлементы содержатся в море в большой массе и по своему количеству не лимитируют рост водорослей. Относительно роли микроэлементов сведений получено мало. Однако в отдельных работах отмечается линейная зависимость между продуктивностью водорослей и концентрацией некоторых микроэлементов в морской воде (Орадовский, 1971).
Азот. Этот элемент входит в состав белков,и обеспеченность им клеток определяет весь процесс биосинтеза. В природных условиях азот является одним из основных факторов,обусловливающих развитие фитопланктона в море. Рост фитопланктона в образцах морской воды Q добавлением азота превышает таковой без добавок и сравним с ростовыми показателями при использовании питательных сред ( Eppley , 1968; Thomas et all , 1972). Лабораторные исследования с культурами морских водорослей показали, что содержащиеся в морской воде концентрации азота недостаточны для реализации максимальных скоростей роста клеток ( Eppley et all , 1969; McCarthy , 1972; Harrison , 1976). В непрерывной культуре скорости роста полностью определяются подачей азота со средой ( Gaperon , Meyer , 1972).
Водоросли способны утилизировать азот практически в любой форме, однако, аммонийный азот быстрее поступает в клетку и, поэтому, используется водорослями в первую очередь ( Fogg, 1952). Молекулярный азот атмосферы потребляется морскими азотфиксирую-щими сине зелеными водорослями ( Allen, 1963).
Различные виды водорослей по разному относятся к концентрациям азота в среде. Наиболее высокие концентрации азота требуют зеленые, несколько меньшие - синезеленые и, затем, диатомовые водоросли (іусева, 1952). Относительно перидиниевых водорослей сведений мало.
Исключение азота из питательных сред быстро приводит к замедлению роста водорослей в непроточной по биогенам культуре: запас азота в клетках достаточен, как правило, для 2-3 кратного деления клеток, после чего их рост полностью прекращается (Кітель зон и др., 1966). В проточной культуре минимальные количества азота в питательной (околоклеточной) среде определяются его пороговым уровнем для клеток. Содержание азота в сухой биомассе водорослей колеблется от 1,5 до 8% (Барашков, 1972). В условиях нормального обеспечения клеток азотом его потребление характеризуется постоянной величиной. Это дает возможность рассчитать концентрации азота в питающей среде, поступающей в суспензию, для получения заданной продуктивности при необходимой ПЛОТНОСТИ культуры и правильно дозировать азот при непрерывном выращивании водорослей (Владимирова и др., 1976).
При высоких концентрациях азота в питательной среде наблюдается ингибирование роста клеток. При этом предельные концентрации намного выше потребностей клеток в азоте. Так, накопительная культура хлореллы нормально растет при начальной концентрации азота в питательной среде до 1,5 г/л (Упитис и др., 1979) и даже до 2 г/л при непрерывном культивировании (Терсков и др., 1964).
Лимитирование роста водорослей азотом приводит к снижению концентрации пигментов в клетках (Садикова и др., 1967; Белянин и др., 1975) и изменению биохимического состава, что является важной предпосылкой для управляемого выращивания водорослей с соответствующим биохимическим составом (Семененко и др., 1968; Тру-бачев и др., 1969).
Несмотря на большое количество работ, посвященных влиянию азота на рост и фотосинтез водорослей, практически отсутствуют сведения о концентрациях азота в питательных средах, обеспечивающих этим элементом рост морских одноклеточных водорослей в плотных культурах. Однако данные по содержанию азота в биомассе этих водорослей позволяют сделать примерную оценку количеств . азота в среде, необходимых для получения той или иной плотности культуры. Результаты опытов с пресноводными водорослями позволяют также оценить максимальные концентрации азота, не ингибирующие роста клеток. Сопоставление этих данных указывает на возможные оптимальные концентрации азота в среде, но для реализации высоких скоростей роста необходимо также одновременно обеспечить потребность клеток в других элементах питания.
Расчет показателей фотосинтеза водорослей
Основными измеряемыми показателями процесса выращивания водорослей были: оптическая плотность опытного слоя суспензии в области V00-750 нм, концентрация сухой биомассы, концентрация клеток и объемная концентрация плотного осадка сырой биомассы. Оптическую плотность суспензии измеряли на регистрирующем спектрофотометре СФ-І4. Запись спектров производили в круглой фотометрической кювете, толщина кюветы в зависимости от плотности культуры выбиралась равной 0,3; 1,0; 2,0; 3,0 см. При высоких оптических плотностях культуры суспензию разводили питательной средой в необходимом соотношении. Концентрацию сухой биомассы в опытной суспензии определяли путем центрифугирования 10-250 мл взвеси клеток при 2000 об/мин. После слива надосадочной жидкости клетки промывали водопроводной водой, которую затем вновь отделяли от клеток центрифугированием. После двухкратной такой промывки полученную биомассу высушивали в течение суток при Ю5С и определяли вес сухого вещества водорослей в заданном объеме суспензии - пробы. Подсчет числа клеток в единице объема суспензии производили в камере Горяева по стандартной методике. Объем плотного осадка сырой биомассы определяли центрифугированием (при 6000 об/мин в течение 15 мин) фиксированного объема суспензии в специальных стеклянных пробирках, нижняя часть которых сужена и проградуирована. Параллельные определения сухого веса и объема плотного осадка клеток позволили определить коэффициенты перевода этих величин. Для платимонаса коэффициент равен 0,17 + 0,02 г(сух.б.)/мл, где в мл представлена концентрация плотного осадка клеток; для порфиридиума эта величина при 10 мин центрифугирования составляет 0,11 + 0,03 г(сух.б.)/мл. Калорийность сухой биомассы определяли прямым сжиганием в калориметрической бомбе прибора Б-8. В результате семи измерений калорийность платимонаса найдена на уровне 4,8 + 0,1 ккал/г(сух. б.). 2.4. Расчет показателей фотосинтеза водорослей. Концентрация хлорофилла а. Для определения концентрации хлорофилла а суспензию центрифугировали, а осадок расуспенди-ровали смесью ацетона с 10% долей этилового спирта.
Полученную суспензию растирали в фарфоровой ступке со стеклянным песком, после чего ее пропускали через стеклянный фильтр №4 и затем спектрофотометрировали (Шлык, 1966). Для подсчета концентрации Хлорофилла а (мг/л) ПОЛЬЗОВаЛИСЬ формулой (Jeffrey , Humphrey , 1975) где О 664 - оптическая плотность вытяжки пигмента при длине волны 664 нм; JD g - оптическая плотность вытяжки при 647 нм. Параллельные измерения концентрации хлорофилла а и оптической плотности в области 680 нм, измеренной относительно 730 нм ( AD 680), позволили определить коэффициент перевода данной оптической плотности в концентрацию хлорофилла а .
Для платимона-са при использовании спектрофотометрической кюветы толщиной 2 см этот коэффициент равен 7,70 10"" г(хл. а)/л«(ед.опт.пл.), т.е. совпадает с найденным для хлореллы (Сидько, 1961). Продуктивность культуры. Абсолютная скорость роста водорослей (продуктивность, Р ) по определению равна Р - dy/ctz где ,cLx - прирост биомассы водорослей на единицу объема или освещаемой поверхности за время ccz . На линейном участке накопительного роста можно использовать также выражение для Р (через полные дифференциалы): Р = л У/Д. - = (У-У) /( о) , где У о - концентрация биомассы в момент времени zfo t X -концентрация биомассы в момент времени . Эта формула справедлива не только в случае линейного увеличения биомассы со временем, но также и для малых отрезков времени а С . Удельная скорость роста. Это понятие было введено Блэкма-ном ( Blackman , 1919) и записывается как: В случае линейного роста культуры можно воспользоваться: где Хер - средняя концентрация биомассы на отрезке времени л6 . Для области экспоненциального роста клеток в культуре (когда QJ. Z cortS t ) выражение для fU. имеет вид: где 5j - спектральная плотность энергии источника света; 3 _ спектральное пропускание суспензии. На рис. I представлена зависимость коэффициента поглощения платимонаса от величины оптической плотности AD ggQ, с учетом распределения энергии в спектре лампы КИ 220-1000-3. Энергетический КПД фотобиосинтеза. Эффективность утилизации растениями световой энергии в области.ФАР определяется отношением скорости запасания энергии в продуктах биосинтеза фотосиы-тезирущих клеток к интенсивности поглощения ими света: где Д- - калорийность биомассы в соответствующих энергетических единицах. Определение оптимальных концентраций железа и микроэлементов и их соотношений в питательной среде проводили с помощью методов планирования эксперимента. Применяли метод Бокса-Уилсона (Адлер и др., 1971). Опыты были поставлены по ортогональной матрице для ПФЭ 24 и ДФЭ 24- . По результатам опытов составлялись уравнения линейной регрессии в виде: где у. - параметр оптимизации; У± , #z & - значения уровней изучаемых факторов; ё± , о г ,... & - коэффициенты регрессии, характеризующие степень влияния факторов на параметр оптимизации; о о - величина, равная среднему значению (из всех опытов) параметра оптимизации. Коэффициенты регрессии для каждого фактора (с учетом их комбинаций) вычислялись по формуле: где " _ число опытов; tfj - среднее значение параметра оп- тшизации для одного опыта, L - последовательности факторов и их комбинаций, - общее число факторов.
Рост водорослей в зависимости от концентрации железа в среде
Платимонас. Как показали эксперименты с азотом и фосфором, рост платимонаса зависит не только от концентрации этих элемен-.тов в питательной среде, но и от наличия микроэлементов и железа. Для определения оптимальных концентраций железа в среде были проведены опыты по изучению влияния различных концентраций железа на рост платимонаса в накопительной культуре. В этом эксперименте использовалась питательная среда, показавшая наилучший рост платимонаса. Концентрации элементов составляли: азот - 300; фосфор - 60; марганец - 0,5; кобальт - 0,5; молибден - 0,5 мг/л. Концентрацию железа варьировали от 0 до 9,5 мг/л. В качестве хе-латирующего агента в среду вводили трилон Б в количестве 37 мг/л. Культуру предварительно содержали на среде, лишенной железа. Результаты опытов приведены на рис. 7. Из рисунка видно, что скорость роста увеличивается с повышением концентрации железа в среде как в экспоненциальной, так и в линейной фазах роста, но до определенного предела. Увеличение концентрации железа более 8 мг/л уже не приводит к увеличению скорости роста.
Это следует из сравнения опытов 4 и 5, в которых рост был практически одинаковым. Следовательно, 8 мг/л можно считать оптимальной концентрацией железа в среде для платимонаса. Необходимо, однако, отметить, что рост (хотя и замедленный) наблюдается такие и без добавления железа в среду (опыт I). Вероятно, это обусловлено тем, что естественная морская вода содержит некоторое количество этого элемента, чем и обеспечивается рост клеток. Возможно, этому способствовало некоторое количество данного элемента, адсорбированного (накопленного ранее) клетками. При расчете питательных сред, приготовляемых на естественной морской воде, необходимо учитывать этот факт и производить соответствующую их коррекцию по железу для обеспечения максимального роста водоросли. Расчет концентрации железа для нелимитируемого роста платимонаса также должен учитывать плотность культуры. Как видно из опытных данных, концентрация железа 8 мг/л обеспечивает нелимитируемый рост платимонаса при высокой плотности клеток. Для культур малой плотности достаточно 4 мг/л железа. При такой концентрации железа нелимитируемый рост наблюдался при проточном выращивании платимонаса.
Эти данные хорошо согласуются с результатами химического анализа платимонаса, который показал содержание этого элемента в сухой биомассе 1,0-1,3 мг/г(сух.б.), т.е. концентрация железа 4 мг/л обеспечивает прирост биомассы до 3 г(сух.б.)/л. Гимнодиниум. При проведении опытов с целью изучения влияния железа на рост гимнодиниума культуру предварительно выдерживали на лишенной железа среде при концентрации азота - 16,5; фосфора - 2,7 мг/л. Микроэлементы - по прописи Арнона; в среду добавляли витамин Bjg (5 мкг/л). В качестве хелатирущего агента использовали трилон Б (37 мг/л). В этих опытах измеряли удельную скорость роста гшлнодішиума в экспоненциальной фазе роста периодической культуры. Испытыва-лось действие концентраций железа 0,05; 0,5; 2,5 и 4,5 мг/л при плотности культуры от 0,2 до 0,4 млн кл./мл. Результаты опытов показали, что удельная скорость роста гимнодиниума лимитируется этим элементом при концентрации железа ниже 2,5 мг/л (рис. 8). Так, при концентрации железа 0,05 мг/л —т удельная скорость роста составила 0,08 + 0,01 сут. , а при 0,5 мг/л - 0,13 + 0,02 сут. . Эти значения ниже величин, наблюдаемых при 2,5 и 4,5 мг/л, которые составили 0,18 + 0,02 и 0,19 + 0,02 сут. , соответственно. Полученные результаты удовлетворительно описываются уравнением Моно (рис. 8). Дяя выяснения зависимости роста гимнодиниума от концентрации железа при высокой плотности клеток (1-2 млн кл./мл) были проведены дополнительные опыты, в которых концентрации азота и фосфора были увеличены в 2 раза для обеспечения потребности клеток в этих элементах при данной плотности. Результаты опытов приведены на рис. 9, из которого видно, что продуктивность гим-нодиниума лимитировалась железом при концентрациях ниже 3 мг/л. Зависимость продуктивности от концентрации железа линейна до 3 мг/л. Эти данные показывают, что рост гимнодиниума определяется не только концентрацией железа в среде, но и плотностью культуры. Результаты также позволяют сделать оценку потребности гимнодиниума в железе, которая составляет около 1,5 мг железа для прироста 10 клеток или 0,3-0,5 г(сух.б.). Такие добавки железа не лимитируют рост гимнодиниума и обеспечивают относительно высокую продуктивность культуры. При проведении опытов с азотом и фосфором было установлено, что рост платимонаса определяется не только концентрацией этих элементов, но и наличием в среде микроэлементов и железа. Для выяснения зависимости скорости роста от концентрации микроэлементов в среде нами использован полунепрерывный способ культивирования, который заключался в следующем. В одно и то же время суток определяли оптическую плотность взвеси клеток, после чего часть суспензии сливали и доливали такое количество опытной питательной среды, чтобы значение д) 6QQ устанавливалось равным 0,33. Эта величина aD для слоя суспензии 3 см была выбрана за базовый уровень, который соответствует поглощению культурой 36-40% энергии действующего потока ФАР. Объем сливаемой и доливаемой питательной среды ( Ih. ) вычислялся по уравнению: й = Й ( й.Ъ ggQ - 0,33)/ д-D ggg, где tfb - 225 мл - объем суспензии в колбе ( 1?с. в мл). Изучение полной кривой роста клеток показало, что в таком режиме культивирования водоросли постоянно находились в экспоненциальной фазе роста. Поэтому удельная скорость роста ( L ) клеток за период между последовательными разведениями суспензии определялась по формуле: 1 = ( &П дВ 680-- п 0,33)/ лі , где at -длительность этого периода (I сут.). Для опытов брали клетки, предварительно выдержанные в среде, лишенной изучаемых микроэлементов. Затем в течение трех суток водоросли адаптировались к режиму культивирования и опытным концентрациям микроэлементов. Весь эксперимент проводился в течение II суток. Определение оптимальных концентраций микроэлементов и железа, а также их соотношения в среде проводили по методу Бок-са-Уилсона. В опытах изучали влияние железа, марганца, кобальта и молибдена на удельную скорость роста. Опыты были поставлены по ортогональной матрице для ТЩ 2 .
Зависимость содержания клеточных пигментов от световых условий
Содержание пигментов в клетках микроводорослей является величиной, зависящей от многих факторов: рН, температуры, минерального и углеродного питания, световых и других условий культивиро зания клеток. Важнейшим из этих факторов является действующий и поглощаемый световой поток. Действие света на водоросли проявляется не только в качестве источника энергии для метаболических процессов, протекающих в клетке, но и в качестве регулятора процессов. Так, регуляция поглощения энергетических потоков идет че рез изменение содержания и соотношения пигментов, что приводит к изменению интенсивности и количества световой энергии, поступающей в клетку. Механизм явления световой адаптации пигментов далеко не ясен.
Однако, многочисленные проведенные исследования ука зывают на однозначное действие света на пигменты: с ростом интен » сивности света содержание пигментов в единице биомассы уменьшает ся. Такая реакция пигментов микроводорослей объясняется тем, что в них под действием интенсивного света наравне с синтезом происхо» дит деструктивное фотоокисление пигментов (Красновский, 1967). Рассмотрим процесс разрушения пигмента под действием света и определим зависимость содержания пигментов в биомассе клеток от интенсивности света в условиях непрерывного стационарного процесса культивирования водорослей, В таком процессе измеряемыми вели» чинами являются стационарные концентрации пигмента ( ОІ ) и био массы (JO. выход пигмента (наблюдаемая скорость синтеза, VH ), продуктивность по биомассе (Я), удельная скорость выхода пиг» мента ( /Lin ) и биомассы { /л.х ) Величина относительного содержания пигмента в биомассе клеток определяется отношением стационарных концентраций пигмента и биомассы: р = Pt/X . Аналитическое выражение для выхода пигмента получим (путем умножения удельной скорости на стационарную концентрацию): Аналогично для продуктивности: Разделив (4.28) на (4.29), имеем: В стационарном непрерывном процессе: (LLf?=(Ux Следова тельно, выражение для J будет: т.е. содержание пигментов в биомассе определено отношением выхода пигмента к продуктивности клеток. Теперь следует учесть, что выход пигмента определяется двумя процессами - синтезом и разру » шением. Обозначив скорость синтеза пигмента Vr $ а скорость разрушения VP , запишем выражение для выхода пигмента:
Отношение максимальной скорости синтеза пигмента к продукт тивности показывает величину максимального содержания пигментов в биомассе ( 6т ): Введем безразмерную величину л : Исходя из (4,30) и (4.31), имеем: Записав для и подставляя (4.16) и (4.22) в (4.21), получаем выражение для f : здесь Jtr -Jt+fcp - общая концентрация пигмента; 2/ ««кон- центрация разрушенного пигмента. Таким образом, задача сводится к определению отношения стационарной концентрации пигмента, наблюдаемой в процессе выращивания, к общей концентрации пигмента, синтезируемого в клетках. Схему деструктивного фотоокисления пигмента можно представить следующим образом. При поглощении дозы световой энергии оп ределенной длины волны, приводящей пигмент к разрушению, пигмент переходит в фотоокисленное состояние. В течение времени л пиг» мент находится в окисленной форме, после чего он либо разрушает ся, либо переходит в основное состояние (восстанавливается). Дозу световой энергии, поглощенной одним пигментом (или единицей пигмента) можно определить как отношение энергии, поглощаемой всеми пигментами за время да. , к общему количеству пигментов: где С/р - интенсивность поглощения всеми пигментами света в спектральной области, приводищей пигмент к разрушению. В фотобиологии хорошо известна зависимость, связывающая от» ношение числа молекул или клеток, пораженных действием радиации или другого разрушающего фактора, к начальному числу молекул или клеток, с дозой действующей радиации. Эта зависимость вытекает из рассмотрения статистики Цуассона для системы "квант поглсь» щающее вещество" и для нашего случая может быть записана: где: JL L. « число фотоокисленных молекул; &р коэффициент. При изменении общего числа пигментов число окисленных пигментов также изменится. Если за время лЬл, синтезировано &Іт пигментов, то число окисленных пигментов за это же время изменит ся на величину: За это же время часть окисленных пигментов разрушится, а часть восстановится ( еЛ ) Количество восстановленных пигмен тов можно определить: где \/ скорость восстановления; а У изменение скорости восстановления за время A L, . В свою очередь, скорость восстав новления определяется выражением: где it І Me - константа восстановления. Подставляя (4.39) в (4.38), имеем: Обозначив uttL/die = CL и учитывая (4.37),получим: Изменение наблюдаемой концентрации пигмента ( & ) определим из балансового уравнения: Подставляя (4.37) и (4.40) в (4.41) и разделив обе части уравне ния на й&т , получим: Легко заметить, что отношение в левой части уравнения представ» ляет собой величину & (4.35), т.е.: В некоторых случаях более удобно пользоваться выражением: где Подставляя (4.36) в (4.42), получим: Как было сказано ранее, У/ « представляет собой интенсив ность поглощения пигментами света в спектральной области, приво дящей пигмент к разрушению. Эта величина определяется зависимо» стью: где У m интенсивность действующего на пигменты света; „ / . ос- da s z- Ю Р « коэффициент поглощения суспензии в разру шающей пигменты области спектра; Я/»2 показатель поглощения в данной области, зависящий от спектральных свойств пигмента и источника света.